氫氣(H2)無色無味，是自然界最小的分子，同時(shí)也是宇宙中含量最多的元素。過去H2被認(rèn)為是生物惰性氣體。近年來，隨著對(duì)其生物學(xué)功能的深入研究，研究人員認(rèn)為H2可能是繼一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)和硫化氫(H2S)之后又一個(gè)重要的氣體信號(hào)分子。2007年Ohsawa等發(fā)現(xiàn)氫氣可顯著改善腦缺血再灌注損傷，由此引起了對(duì)于氫氣的研究熱潮。研究表明，H2對(duì)多種人類疾病和病理狀態(tài)都具有明顯的緩解和治療效果，如氫分子在抗氧化、抗炎癥等方面都發(fā)揮著重要作用。此外，H2在植物學(xué)上也具有重要的生理作用，其不僅可提高植物對(duì)生物/非生物脅迫的抗性，還參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

目前飲用富氫水(hydrogen-rich water，HRW)是常用的攝取氫的方式，水相中氫氣濃度的準(zhǔn)確測(cè)定是各項(xiàng)研究以及后續(xù)生產(chǎn)應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。

目前，測(cè)定溶液中氫氣濃度的方法主要有電極法、氣相色譜法和氧化還原滴定法。電極法是通過測(cè)定溶液中氧化還原電位的變化而確定溶液中氫氣的濃度；氣相色譜法主要依據(jù)樣品成分與色譜柱沸點(diǎn)、極性或吸附性的不同，氣體通過色譜柱時(shí)被分離，各種物質(zhì)到達(dá)檢測(cè)器時(shí)間有所不同，從而可以對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行定性和定量測(cè)定；氧化還原滴定法是利用亞甲基藍(lán)在膠體鉑催化下與氫氣發(fā)生氧化還原反應(yīng)使亞甲基藍(lán)褪色，通過亞甲基藍(lán)的用量計(jì)算出溶液中氫氣的含量，但此方法誤差較大，且準(zhǔn)確度不高。

基于此，本研究利用氫氣微電極和檢測(cè)小體系溶液中氫氣濃度的可行性，以期建立一種可廣泛用于氫氣生物學(xué)研究和相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)的氫氣濃度檢測(cè)方法。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)氮?dú)狻⒀鯕赓?gòu)自北京誠(chéng)為信氣體有限公司。Milli-Q Advantage A10純水設(shè)備購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；ZK-300純水氫氣發(fā)生器購(gòu)自北京中科匯恒技術(shù)開發(fā)有限公司；氫氣微電極購(gòu)自丹麥Unisense公司，SH-RtTM-Msieve 5A色譜柱；氣相色譜瓶購(gòu)自美國(guó)安捷倫科技有限公司。

飽和HRW的制備

將純水氫氣發(fā)生器制得的氫氣(99.999%)通入100 mL超純水(ddH2O)中以制備HRW，每隔10 min使用氫氣微電極測(cè)定一次，直至飽和，氫氣在20℃下溶解度為1.62 mg·L-1[20]。制得飽和HRW后，立即使用ddH2O稀釋，配制成不同濃度的HRW(表1)以用于測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，溶液總體系為500.0μL。

表1高濃度和低濃度HRW配制

電極法測(cè)定HRW中氫氣濃度

電極極化

將氫氣微電極浸泡于ddH2O中，電極極化電壓設(shè)置為1 000 mV，隨后逐漸下降，并最終穩(wěn)定在某一數(shù)值，待此數(shù)值穩(wěn)定10 min以上后，電極極化結(jié)束，可以開始樣品檢測(cè)。電極極化時(shí)間一般需要1～2 h。

樣品檢測(cè)

將500μL不同濃度的HRW置于1.5 mL離心管中，將電極插入液面以下，待信號(hào)值穩(wěn)定后，記錄數(shù)據(jù)。

結(jié)果

電極法測(cè)定水相中氫氣濃度

標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用氫氣微電極分別測(cè)定高濃度HRW(0、0.324 0、0.648 0、0.972 0、1.296 0、1.620 0 mg·L-1)及低濃度HRW(0、0.040 5、0.081 0、0.121 5、0.162 0、0.202 5 mg·L-1)中氫氣的濃度。以水相中氫氣濃度為縱坐標(biāo)，以氫電極的信號(hào)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1A所示，高濃度HRW標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001 402x-0.028 35，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 8；如圖1B所示，低濃度HRW標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001 580x-0.030 28，R2=0.999 7。因此，低濃度、高濃度HRW中，水相中氫氣濃度與氫氣微電極信號(hào)值之間均具有良好的線性關(guān)系。

圖1氫電極法檢測(cè)水相中氫氣濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確度分析及檢出限分析

利用氫氣微電極對(duì)某一高濃度(0.72 mg·L-1)、低濃度(0.012 mg·L-1)樣品進(jìn)行9次平行測(cè)定，對(duì)該測(cè)定方法進(jìn)行精確度分析，由表2可知在0～1.620 0 mg·L-1范圍內(nèi)，該方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.012 9 mg·L-1，變異系數(shù)為1.775 3%。結(jié)果表明該方法精確度較高，滿足水相中高濃度氫氣的測(cè)定要求。

表2電極法檢測(cè)高濃度和低濃度HRW的精確度分析

由表2可知,在0～0.202 5 mg·L-1范圍內(nèi)，用電極法測(cè)定低濃度HRW的樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.001 3 mg·L-1，變異系數(shù)為11.734 0%。根據(jù)1.5中的公式，t(8,1-a=0.99)=3.355 0，MDL=S×t(8,1-a=0.99)=0.004 4 mg·L-1。表明該方法精確度較高，滿足水相中低濃度氫氣的測(cè)定要求。

綜上所述，對(duì)于需要實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的樣品，使用氫微電極法較為合適。從檢測(cè)方式來看，電極法可以直接實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)水相中氫氣的濃度；但從測(cè)定原理來看，電極法根據(jù)溶液中氧化還原電位的變化而測(cè)定溶液中氫氣的含量，由于生物樣本成分較為復(fù)雜，電極法的測(cè)定結(jié)果容易受到多種因素的干擾。