為了便于鏡下觀察，基于細(xì)胞培養(yǎng)的嗅球神經(jīng)元是主要的實(shí)驗(yàn)對(duì)象之一。目前對(duì)離體嗅球神經(jīng)元的電信號(hào)檢測(cè)主要是膜片鉗記錄技術(shù)。隨著微電子機(jī)械加工技術(shù)(MEMS)的發(fā)展，微電極陣列(microelectrode array，MEA)、光尋址電位傳感器(light addressable potentiometric sensor，LAPS)和場(chǎng)效應(yīng)晶體管(field effect transistor，F(xiàn)ET)等微傳感技術(shù)在生物信號(hào)檢測(cè)中得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。曾經(jīng)將嗅球神經(jīng)元培養(yǎng)在LAPS芯片上觀察氣味對(duì)僧帽細(xì)胞有無(wú)響應(yīng)，作為研究嗅覺(jué)受體神經(jīng)元對(duì)氣味響應(yīng)的實(shí)驗(yàn)對(duì)照。下面是操作步驟：

1.1器件準(zhǔn)備

微電極陣列MEA的制作采用標(biāo)準(zhǔn)微電子制作工藝：5吋玻璃基底(厚度500μm)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)清洗后在表面磁控濺射一層厚度100～500?的Cr或Ti-W薄膜作為中間層，然后再濺射厚度為2000～5000?的Au薄膜形成電極層;濺射完成后，沉積一層聚酰亞胺或光刻膠作為絕緣層，并通過(guò)反應(yīng)離子刻蝕技術(shù)(reactive ionetching，RIE)刻蝕暴露出金電極陣列圖形。將器件固定在PCB座上，利用點(diǎn)焊技術(shù)將器件上的焊點(diǎn)與PCB板上的焊盤用金線連通。然后用生物相容性較好的環(huán)氧樹(shù)脂覆蓋焊絲，粘接測(cè)試腔，室溫固化，得到如圖1(a)所示的器件。

圖1器件。(a)封裝的器件;(b)電鍍鉑黑的MEA顯微照片

為了降低熱噪聲，提高細(xì)胞胞外信號(hào)檢測(cè)的信噪比，本實(shí)驗(yàn)對(duì)MEA金電極表面電鍍鉑黑顆粒，以增加電極的表面積，降低電極阻抗。電鍍系統(tǒng)采用三電極系統(tǒng)與CHI660 C型電化學(xué)工作站，每個(gè)電極的電鍍時(shí)間約45 s。最后得到的MEA顯微如圖1(b)所示，電極直徑為30μm。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

嗅球細(xì)胞的培養(yǎng)與大多數(shù)神經(jīng)元培養(yǎng)方法相似。將新生SD乳鼠(1～3 d)剪取鼠頭，將其放入酒精中消毒1～2 min后，立即轉(zhuǎn)入盛有磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中。剪開(kāi)頭皮，撥開(kāi)顱骨，暴露全腦。輕輕剝離兩側(cè)嗅球，放于另一無(wú)菌盛有PBS的培養(yǎng)皿中。輕輕剝?nèi)ケ荒ぃ缓髮⑿崆蚣舫? mm3左右的組織塊，加入2 mL含10μg/L神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)的DMEM(Dulbecco＇s modified eagle＇s medium)培養(yǎng)液中進(jìn)行吹打，制成細(xì)胞懸液，接種在MEA表面。24 h后全量換液，48 h后滴加5-氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)。每3 d換液一次。培養(yǎng)5～7 d后，可以將芯片取出進(jìn)行觀察和測(cè)試。

1.3染色處理

為了更加清楚地觀察嗅球神經(jīng)元的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，信號(hào)測(cè)試結(jié)束后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色處理。本實(shí)驗(yàn)采用瑞士染色法，染液包括Ⅰ和Ⅱ兩組份，由堿性染料美藍(lán)和酸性染料伊紅分別配制而成。首先將細(xì)胞培養(yǎng)腔內(nèi)的神經(jīng)測(cè)試液吸干;然后滴加適量染液Ⅰ于培養(yǎng)腔內(nèi)，保證溶液浸沒(méi)細(xì)胞;1 min后將等量的染液Ⅱ滴加入培養(yǎng)腔，保證染液Ⅰ、Ⅱ均勻混合;大約5 min后用清水沖洗數(shù)遍;將培養(yǎng)腔內(nèi)溶液吸干，置于顯微鏡下觀察。

1.4信號(hào)采集與分析

利用多通道放大器(MEDl6，Multichannel systems，GmbH，德國(guó))，本實(shí)驗(yàn)可以實(shí)現(xiàn)16通道的同步記錄，采樣頻率為10 kHz。

為了評(píng)估嗅球細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器的檢測(cè)能力，選用嗅球內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(glutamic acid，Glu)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究[19]，觀察了Glu作用前后不同通道嗅球神經(jīng)元的響應(yīng)。Glu溶液由正常神經(jīng)測(cè)試液配制而成，最終濃度為200μM。

信號(hào)的統(tǒng)計(jì)分析圖和光柵圖均通過(guò)Matlab軟件完成。