使用離體培養(yǎng)的小鼠的血管紋中間細(xì)胞，用記錄離體的中間細(xì)胞的膜電位的方法，觀察順鉑是否能夠影響中間細(xì)胞上的離子通道和離子泵。

內(nèi)淋巴電位及胞外電位的測量

動物腹腔注射麻醉劑（氯胺酮90 mg/kg+甲苯噻嗪4.5 mg/kg），麻醉滿意后，在隔音屏蔽室內(nèi)，將動物腹側(cè)向上放置于保溫墊上，使其體溫維持于37°C。固定頭部及四肢。頸部正中皮毛備皮。頸部正中切口，手術(shù)顯微鏡下分離皮下組織及肌肉，做氣管切開。進(jìn)一步分離頸部肌肉組織，并分離聽泡表面附著軟組織，暴露聽泡。充分止血后開放聽泡，充分暴露鐙骨動脈，耳蝸底轉(zhuǎn)。

內(nèi)淋巴電位的記錄方法在以前發(fā)表的文章里已有詳細(xì)介紹[16-21]。我們選擇耳蝸底轉(zhuǎn)來進(jìn)行內(nèi)淋巴電位測量。玻璃微電極（直徑為1μm，輸入阻抗10-20 MΩ）固定于微操縱器上，電極內(nèi)充滿150 mM KCl溶液。參考銀球電極埋入同側(cè)頸部肌肉內(nèi)。使用微操縱器將玻璃微電極由圓窗插入,緩緩?fù)七M(jìn)，電極與耳蝸表面接觸時調(diào)整記錄信號的基線為零。經(jīng)鼓階通過穿透基底膜進(jìn)入中階（圖1A)后，觀察到一個穩(wěn)定的直流電位。使用Axopatch 200B放大器(Molecular Probe,Sunnyvale,CA)來放大電信號（濾過頻率為1 kHz）。使用16位A/D轉(zhuǎn)換器進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換。使用pClamp10.0的軟件進(jìn)行信號采集。采樣頻率設(shè)定在10 kHz。

通常采用圓窗電極的方法記錄微音電位[18-21]。我們采用插入鼓階中記錄內(nèi)淋巴電位的微電極記錄胞外電位（即微音電位）。記錄胞外電位時，我們采用4kHz的短純音，升降時間為0.1ms，時程1秒，強(qiáng)度為85dBSPL。聲音由信號發(fā)生器產(chǎn)生，經(jīng)放大后由揚(yáng)聲器（MF1-S，TDT）給出。在記錄胞外電位時，用Axopatch 200B放大器放大信號，濾過頻率為10kHz，采樣頻率為50kHz。

圖1記錄成年小鼠耳蝸EPFig.1 Recording EP from adult mouse cochleaeA:使用微電極通過耳蝸基底膜記錄內(nèi)淋巴電位(EP)的示意圖。IHC：內(nèi)毛細(xì)胞；OHCs：外毛細(xì)胞。B:從小鼠耳蝸底轉(zhuǎn)記錄到的內(nèi)淋巴電位，紅色箭頭所指為電極插入、退出中階的時間點。C:從小鼠耳蝸底轉(zhuǎn)記錄到的內(nèi)淋巴電位和胞外電位。在記錄內(nèi)淋巴電位過程中，用4kHz的短純音誘發(fā)胞外電位（即耳蝸微音電位）。放大的胞外電位顯示在圖C的插圖中。

中間細(xì)胞培養(yǎng)

將生后5天C57BL/6J小鼠的內(nèi)耳組織取出，分離出耳蝸中轉(zhuǎn)、頂轉(zhuǎn)的血管紋。將分離獲得的血管紋組織放入預(yù)先準(zhǔn)備好的裝有DMEM的培養(yǎng)皿中，然后鋪平將其放入到培養(yǎng)箱中。兩個小時后加入少量胎牛血清使其濃度達(dá)到5-10%之間。次日早晨將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基更換成PVM細(xì)胞專用培養(yǎng)基。在培養(yǎng)過程中，中間細(xì)胞會從血管紋中遷移出來，培養(yǎng)5-7天后，大部分中間細(xì)胞已經(jīng)遷移出血管紋。由于其含有色素，中間細(xì)胞非常易于辨認(rèn)。

使用全細(xì)胞膜片鉗記錄細(xì)胞靜息電位

使用Olympus BX51WI正置顯微鏡和Axo?patch 200B放大器,來進(jìn)行全細(xì)胞電壓/電流鉗記錄。微電極使用3D的微操縱器來控制(MHW-3,Narishige,日本)。微電極是使用顯微拉制儀從直徑1.5 mm玻璃管(A-M Systems,Carlsborg公司)拉制而成。記錄電極的電阻為3-4 MΩ,內(nèi)充的溶液的成分(mM)為150 KCl,2 MgCl2,1 EGTA,10 HEPES,使用KOH將pH調(diào)節(jié)到7.3。全細(xì)胞膜片鉗建立好后,整個通路的串聯(lián)電阻為8-12 MΩ。