看法

探針耗氧量的方法學(xué)方法。 為了確保微探針的耗氧量與細(xì)菌的耗氧量相比可以忽略不計，我們在24小時內(nèi)平行培養(yǎng)過程中監(jiān)測了相同水的0.6-μm和0.2-μm過濾子樣本中的氧濃度（圖2）。 0.2-μm過濾水中的氧濃度在培養(yǎng)0至15 h期間保持恒定（215μm O2，圖2）。 培養(yǎng)15小時后觀察到的減少是由于通過過濾器的殘留小細(xì)菌的生長和/或由于儀器無法進(jìn)行高壓滅菌而污染樣品造成的。 對于在含有大多數(shù)細(xì)菌的0.6μm（圖2）上過濾的樣品（平均值為90%±4%，n=31，Torréton等人未經(jīng)過濾的數(shù)據(jù)未經(jīng)過濾），這種殘留污染可以忽略不計。 微探針不消耗氧氣是一個相當(dāng)大的優(yōu)勢，因?yàn)樵诟∮嗡蛑惺褂玫拇蠖鄶?shù)氧氣測量設(shè)備都涉及氧氣宏觀探針（Griffith 1988；Langdon 1993），其顯示內(nèi)部氧氣消耗，導(dǎo)致氧氣消耗的高估，除非糾正。

圖2. 站N12（2003年5月6日）0.6-和0.2-μm過濾子樣本暗培養(yǎng)期間的氧氣濃度。

再現(xiàn)性。 使用Winkler方法的耗氧量估計通常是重復(fù)進(jìn)行的。 在我們的研究中，測量氧氣濃度的設(shè)備的可用性使我們無法在重復(fù)中系統(tǒng)地估計氧氣消耗量。 然而，在一些情況下，我們檢查了重復(fù)水樣的再現(xiàn)性。 圖3顯示了同一站點(diǎn)的兩個樣本中氧氣濃度的時間過程非常相似。

圖3. 在N12站（2003年4月10日）0.6-μm過濾子樣本的黑暗培養(yǎng)期間的氧氣濃度。

氧微探針的精密度。 表2顯示了用于測量浮游生物系統(tǒng)中氧濃度的不同技術(shù)。 Winkler技術(shù)是最常用的技術(shù)，已經(jīng)開展了許多工作來提高這種化學(xué)測定氧濃度的精度。 氧微探針的精度（0.05%）相當(dāng)于Roland等人（1999）和Sherr及Sherr（2003）所述的高精度Winkler技術(shù)。

<0.6-μm過濾樣品中的呼吸趨勢-離散O2或CO2測量用于估計呼吸的一個主要缺點(diǎn)是，它們需要較長的培養(yǎng)時間才能觀察到與初始氧氣濃度的顯著差異。 然后假設(shè)耗氧量是線性的，這通常不容易用溫克勒滴定法在短時間內(nèi)驗(yàn)證。 在之前的一項(xiàng)研究中，Pomeroy等人（1994年）觀察到在每5小時進(jìn)行一次離散氧測量的24小時孵化期間氧濃度時間過程的不同趨勢。 他們?nèi)种坏臄?shù)據(jù)沒有顯示氧濃度隨時間的線性下降。 因此，他們建議持續(xù)監(jiān)測氧氣濃度，以便更好地估計細(xì)菌呼吸。 然后假設(shè)耗氧量是線性的，這通常不容易用溫克勒滴定法在短時間內(nèi)驗(yàn)證。在之前的一項(xiàng)研究中，Pomeroy等人（1994年）觀察到在每5小時進(jìn)行一次離散氧測量的24小時孵化期間氧濃度時間過程的不同趨勢。他們?nèi)种坏臄?shù)據(jù)沒有顯示氧濃度隨時間的線性下降。因此，他們建議持續(xù)監(jiān)測氧氣濃度，以便更好地估計細(xì)菌呼吸。

氧氣微探針的使用使我們能夠連續(xù)跟蹤呼吸瓶中的氧氣濃度。 然后將氧濃度數(shù)據(jù)與時間擬合成指數(shù)衰減方程，然后根據(jù)擬合函數(shù)的一階導(dǎo)數(shù)計算呼吸的時間過程。 同時，在重復(fù)0.6-μm過濾樣品的24小時黑暗培養(yǎng)期間，每5小時測定一次3H-胸腺嘧啶核苷摻入和細(xì)菌豐度。 圖4顯示了兩種對比營養(yǎng)狀態(tài)下（M10，貧營養(yǎng)狀態(tài)，D01，富營養(yǎng)狀態(tài)，見圖1）的呼吸、細(xì)菌豐度和細(xì)菌產(chǎn)生的時間過程。

圖4. 來自富營養(yǎng)化D01（a）和貧營養(yǎng)化場地M10（B）的0.6μm濾液的細(xì)菌豐度（?）、TdR摻入（）和呼吸（-）。 條形代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。

在富營養(yǎng)化現(xiàn)場樣品中，顯著的呼吸僅在2至3小時后出現(xiàn)（圖4A），而在貧營養(yǎng)現(xiàn)場樣品中，僅在8至10小時后出現(xiàn)（圖4B）。

在D01（圖4A）中，TdR摻入率顯著增加，在孵育24小時內(nèi)從6 pM h增加到180 pM h–1。 培養(yǎng)結(jié)束時，細(xì)菌豐度達(dá)到初始值的5倍。 呼吸在培養(yǎng)2小時后達(dá)到最大值（2.5μM O2 h–1），然后下降，直到培養(yǎng)15小時后變得幾乎為零。 TdR和細(xì)菌豐度的增加表明細(xì)菌可能不受資源限制。 觀察到的生產(chǎn)和消費(fèi)之間的差異表明，正如del Giorgio和Cole（1998）所建議的，這兩個過程之間存在時間上的不耦合。 培養(yǎng)結(jié)束時，細(xì)菌豐度達(dá)到初始值的5倍。呼吸在培養(yǎng)2小時后達(dá)到最大值（2.5μM O2 h–1），然后下降，直到培養(yǎng)15小時后變得幾乎為零。TdR和細(xì)菌豐度的增加表明細(xì)菌可能不受資源限制。觀察到的生產(chǎn)和消費(fèi)之間的差異表明，正如del Giorgio和Cole（1998）所建議的，這兩個過程之間存在時間上的不耦合。

來自寡營養(yǎng)部位的樣本（圖4B）在數(shù)小時的滯后期后顯示胸腺嘧啶核苷摻入增加。類似地，顯著呼吸僅在6小時的滯后期后才可測量，并且速率（0.6μM O2 h–1）在接下來的15小時內(nèi)幾乎保持不變，而胸腺嘧啶核苷摻入率持續(xù)增加，直到培養(yǎng)結(jié)束時達(dá)到45 pM TdR h–1。在最初的15小時內(nèi)，細(xì)菌數(shù)量增加了2.5倍，并在1.4×106細(xì)胞mL–1附近達(dá)到一個平臺。

這些結(jié)果允許優(yōu)化培養(yǎng)時間，以測量貧營養(yǎng)和富營養(yǎng)場所異養(yǎng)細(xì)菌的耗氧量。此外，3H-胸腺嘧啶核苷摻入和細(xì)菌豐度的平行趨勢證明了該方法的局限性。事實(shí)上，應(yīng)謹(jǐn)慎解釋結(jié)果，考慮到測量結(jié)果更能代表瓶內(nèi)培養(yǎng)過程中發(fā)生的過程，而不是初始原位條件。

M10站的結(jié)果表明，只有當(dāng)細(xì)菌數(shù)量和活性增加時，才能觀察到顯著的耗氧量。這種活性的增加可能是由于>0.6μm生物體的捕食釋放、過濾過程中脆弱細(xì)胞的破壞、玻璃材料上有機(jī)物的瓶效應(yīng)吸附和濃縮，或培養(yǎng)過程中細(xì)菌群落的變化（Sch?fer等人，2000年；Massana等人，2001年；Fuchs等人，2000年；Gattuso等人，2002年）。Biddanda等人（1994年）已經(jīng)表明，在墨西哥灣北部不同營養(yǎng)狀態(tài)的水域中培養(yǎng)期間，細(xì)菌的豐度和活性都會增加。在他們的研究中，在培養(yǎng)20小時后，高產(chǎn)陸架水域和低產(chǎn)坡水域的細(xì)菌產(chǎn)量分別增加了12倍和8倍。Likew在ise中，富營養(yǎng)化場所的細(xì)菌豐度增加了1.5倍，而貧營養(yǎng)場所的細(xì)菌豐度保持不變。因此，在這些孵化過程中，群落的進(jìn)化和活性測量并不能真正代表初始條件。

因此，最好在最短的時間內(nèi)培養(yǎng)，以保持最接近初始條件。因此，我們選擇以5小時間隔計算的斜率來測量細(xì)菌呼吸。這一時間是確保氧氣濃度顯著降低的最短時間和最小值之間的最佳折衷時間增加細(xì)菌DNA合成率（1.19±0.21倍）和豐度（1.42±0.09倍）。當(dāng)我們觀察到氧氣顯著減少時，選擇間隔的開始。

連續(xù)O2測量與離散O2測量我們從16個營養(yǎng)狀態(tài)對比的站點(diǎn)共收集了27個樣本（表1）圖5顯示了我們研究期間觀察到的氧濃度的不同時間過程。圖6顯示了估算細(xì)菌呼吸的離散方法和連續(xù)方法之間的比較。

圖5.氧氣濃度和預(yù)測呼吸隨時間變化的不同趨勢表示。n表示我們研究期間觀察到的相應(yīng)病例數(shù)。兩條線表示間隔（5小時）用于計算細(xì)菌呼吸。對于b型和c型，起始點(diǎn)從最小減少0.5μM O2開始設(shè)置（見正文）。

表1.在整個水柱上取樣的站的平均特征

27例中只有9例在孵化期間表現(xiàn)出恒定的O2消耗（模型a，圖5和圖6）因此，在計算細(xì)菌呼吸時沒有顯示出重要的偏差。在模型a中，估計細(xì)菌呼吸的離散方法將給出與通過連續(xù)監(jiān)測氧氣濃度所估計的結(jié)果相似的結(jié)果。該模型表征了顯示低凈細(xì)菌產(chǎn)量的水樣的呼吸（圖7）。

圖6.通過離散和連續(xù)O2測量估計的呼吸比較。對于離散方法，呼吸是根據(jù)孵化開始和結(jié)束時（14小時或24小時）的氧氣濃度之間的差異計算的。

圖7.培養(yǎng)過程中觀察到的平均凈細(xì)菌生物量的分布，作為耗氧量模型的函數(shù)。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

模型b在氧氣減少之前呈現(xiàn)5到10小時的滯后階段。一般來說，該模型是開放瀉湖樣帶（圖1）中寡營養(yǎng)樣品（7個樣品中的4個）的特征。在模型b中，通過離散方法估計的呼吸將導(dǎo)致氧消耗率的低估（圖6）。正如模型a所觀察到的，模型b是水樣的特征，表現(xiàn)出較低的凈細(xì)菌產(chǎn)量（圖7）。在模型c中，由于生物量和產(chǎn)量的增加，消耗量隨著時間的推移而增加。因此，與5小時時間間隔內(nèi)的連續(xù)氧氣記錄相比，離散方法會高估BR（圖6）。根據(jù)模型c呼吸的樣本的特征是細(xì)菌凈產(chǎn)量最高（圖7）。最后，在模型d中，斜率在孵化開始時最大，隨后減小。這種趨勢是富營養(yǎng)化場所的特征，可能是由于營養(yǎng)資源的枯竭和隨后異養(yǎng)細(xì)菌活性的降低。對于模型d，用于估計細(xì)菌呼吸的離散方法將導(dǎo)致比使用連續(xù)監(jiān)測確定的值更低的速率（圖6）。

這些不同的模型顯示了氧動力學(xué)的巨大可變性，因此難以選擇如何計算細(xì)菌耗氧量。同樣，在之前的一項(xiàng)研究中，Pomeroy等人（1994年）從24小時培養(yǎng)期間進(jìn)行的離散氧測量中觀察到4種不同的氧趨勢。即使在我們的研究中，模型a/b和c/d可以分配給不同營養(yǎng)狀態(tài)的水，如細(xì)菌生物量凈產(chǎn)量所示（圖7），我們也不能將一個模型分配給任何特征點(diǎn)。這一結(jié)果強(qiáng)調(diào)了需要持續(xù)監(jiān)測浮游微生物的耗氧量，以便以最小偏差評估呼吸速率。

圖8. 用細(xì)菌凈生物量（bgebpnet）估算的BGE與用3H-胸腺嘧啶核苷摻入（BGEBP）測定的細(xì)菌產(chǎn)量估算的BGE之間的關(guān)系。

BGE-BGE的估計通常通過細(xì)菌呼吸計算的細(xì)菌產(chǎn)量（用3H亮氨酸或3H胸腺嘧啶核苷摻入測量）的替代物來確定。在我們的研究中，我們根據(jù)培養(yǎng)過程中觀察到的用于細(xì)菌呼吸測定的豐度變化來估算凈細(xì)菌生物量（見材料和程序）。這樣，控制BGE的兩個進(jìn)程在相同的條件下確定。圖8顯示了用凈細(xì)菌生物量產(chǎn)量（BGEBNET）估算的BGE與用3H-胸腺嘧啶核苷摻入（BGEBP）測定的細(xì)菌產(chǎn)量估算的BGE之間的關(guān)系。除了一個站點(diǎn)外，bgebpnet始終高于BGEBP?？墒褂镁€性回歸（R2=0.75，n=24，P<0.001）將BGEBnet和BGEBP與以下等式關(guān)聯(lián)：

這一趨勢表明，當(dāng)根據(jù)示蹤物摻入估算的細(xì)菌產(chǎn)量估算BGE時，將導(dǎo)致低估細(xì)菌生長效率。這一低估可能是由于確定兩個過程的培養(yǎng)時間存在差異（TdR衍生細(xì)菌生產(chǎn)為1小時，細(xì)菌凈生物量生產(chǎn)為12至24小時）。

用于估計BGE的24小時培養(yǎng)可導(dǎo)致生物量和細(xì)菌產(chǎn)量的強(qiáng)烈變化，如圖4所示。細(xì)菌生物量和產(chǎn)量的這些變化會強(qiáng)烈影響B(tài)GE的測定。圖9顯示了根據(jù)圖4所示數(shù)據(jù)計算的24小時孵育期間BGE的時間過程。在富營養(yǎng)化現(xiàn)場（D01），BGE在孵化開始時等于7%，并且隨著時間的推移而強(qiáng)烈增加，在孵化20小時后達(dá)到53%的最大值。BGE的增加是由于孵化期間呼吸速率的強(qiáng)烈下降，伴隨著恒定的凈生物量細(xì)菌產(chǎn)量（圖4A）。Coffin等人（1993年）觀察到24小時培養(yǎng)期間細(xì)菌豐度和呼吸的類似模式，導(dǎo)致BGE有規(guī)律地增加。類似地，Pomeroy等人（1994年）觀察到氧呼吸減少（使用多點(diǎn)Winkler滴定法）伴隨著由亮氨酸摻入確定的細(xì)菌產(chǎn)量的規(guī)律性增加。這些觀察到的兩個過程的時間過程導(dǎo)致在孵化期間BGE有規(guī)律地增加。高初始呼吸速率伴隨著低細(xì)菌產(chǎn)量（導(dǎo)致低BGE值）可能表明這兩個過程并不像del Giorgio和Cole（1998）之前所建議的那樣耦合。

圖9. 在兩種對比營養(yǎng)狀態(tài)下，BGE在24小時孵化期間的時間過程。 用于計算BGE的數(shù)據(jù)來自圖4。 對于M10站，在10小時間隔內(nèi)計算凈生物量產(chǎn)量，以獲得細(xì)菌豐度的顯著變化。 在兩種對比營養(yǎng)狀態(tài)下，BGE在24小時孵化期間的時間過程。用于計算BGE的數(shù)據(jù)來自圖4。對于M10站，在10小時間隔內(nèi)計算凈生物量產(chǎn)量，以獲得細(xì)菌豐度的顯著變化。

相反，在寡營養(yǎng)站點(diǎn)M10，呼吸作用和細(xì)菌凈生物量的產(chǎn)生隨時間保持不變（圖4B）。 因此，BGE在孵化期間沒有表現(xiàn)出顯著的變化（圖9）。 24小時培養(yǎng)期間BGE的可能變化，如在富營養(yǎng)化現(xiàn)場觀察到的變化，強(qiáng)調(diào)有必要盡可能縮短培養(yǎng)時間，以盡量減少BGE測定中的偏差。 因此，BGE在孵化期間沒有表現(xiàn)出顯著的變化（圖9）。24小時培養(yǎng)期間BGE的可能變化，如在富營養(yǎng)化現(xiàn)場觀察到的變化，強(qiáng)調(diào)有必要盡可能縮短培養(yǎng)時間，以盡量減少BGE測定中的偏差。

使用氧微電極來研究細(xì)菌的呼吸作用以確定浮游細(xì)菌的生長速率——摘要

使用氧微電極來研究細(xì)菌的呼吸作用以確定浮游細(xì)菌的生長速率——材料和程序

使用氧微電極來研究細(xì)菌的呼吸作用以確定浮游細(xì)菌的生長速率——看法

使用氧微電極來研究細(xì)菌的呼吸作用以確定浮游細(xì)菌的生長速率——討論、意見和建議！