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4活體電化學(xué)抗蛋白質(zhì)吸附
腦是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，不僅有神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、小分子，還有生物大分子等，如蛋白質(zhì)。在活體伏安法分析中，當(dāng)微電極被植入到活體腦組織中時(shí)，電極會引發(fā)一系列的排異反應(yīng)，從而影響電極的電化學(xué)分析性能。首先，在電極植入到活體的短時(shí)間內(nèi)，蛋白質(zhì)會非特異性吸附到電極表面，從而使電極的靈敏度迅速下降，響應(yīng)時(shí)間變長。其次，在蛋白質(zhì)吸附之后的幾天內(nèi)，中性粒細(xì)胞的吸附占據(jù)主導(dǎo)地位，在24～48 h后，中性粒細(xì)胞逐漸消失，并被單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞取代，最終在電極周圍形成由巨噬細(xì)胞和膠原蛋白組成的無血管纖維囊（50～200μm），以致使物質(zhì)的傳輸和電子轉(zhuǎn)移受阻，最終導(dǎo)致電極靈敏度下降，甚至使電極失去響應(yīng)。因此，避免蛋白質(zhì)在電極表面的非特異性吸附（即抗生物污染），同時(shí)提高微電極的電化學(xué)性能對活體電化學(xué)的研究至關(guān)重要。
蛋白質(zhì)吸附導(dǎo)致的一個(gè)結(jié)果是微電極必須在植入活體后進(jìn)行校正，通常認(rèn)為電極在植入到腦內(nèi)一段時(shí)間后蛋白質(zhì)吸附會達(dá)到穩(wěn)定，所以選擇在活體實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行電極校正，進(jìn)而分析活體檢測信號。但，活體后校正方法仍存在一些問題。首先，活體分析中使用的碳纖維電極比較脆，從腦中取出時(shí)很容易折斷而無法進(jìn)行后校正實(shí)驗(yàn)。其次，后校正方法的提出是基于在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中電極的靈敏度保持不變，這就要求我們的電極在植入活體后，蛋白質(zhì)能夠迅速吸附并達(dá)到平衡。但，腦內(nèi)蛋白質(zhì)環(huán)境復(fù)雜，且蛋白質(zhì)濃度在不同的生理和病理環(huán)境下可能發(fā)生變化。如干擾素和血小板衍生生長因子等在疾病中濃度會發(fā)生變化，這使得后校正方法對獲取比較真實(shí)的活體檢測信號存在一些偏差。
為了解決蛋白質(zhì)吸附所造成的活體微電極的校準(zhǔn)問題，研究人員提出了一些新的策略。Roberts等基于快速掃描伏安法（FSCV）建立了電極的原位校正方法，該方法借助電極背景中的非法拉第電流等參數(shù)建立模型，通過理論預(yù)測對電極進(jìn)行校正。但該方法僅局限于FSCV，并且影響模型參數(shù)的因素較多，不同的實(shí)驗(yàn)室在使用時(shí)均需要重新測量參數(shù)?？刮鄄牧闲揎楇姌O表面以減小蛋白質(zhì)的非特異性吸附是解決電極靈敏度降低、活體后需要再次校正的另一策略。目前，Nafion，堿處理的醋酸纖維，PEDOT/Nafion等材料在一定程度上可減少蛋白質(zhì)的非特異性吸附。Singh等系統(tǒng)的研究了Nafion、醋酸纖維、牽連蛋白修飾碳纖維電極（CFE）對單胺類遞質(zhì)檢測結(jié)果的影響。他們發(fā)現(xiàn)不同材料修飾電極對電極的靈敏度、選擇性及抗污染性能的影響也不同。有些材料有助于提高電極的選擇性和靈敏度（如Nafion），有些材料則能提高電極的抗污染性能（如醋酸纖維、牽連蛋白）。雖然這些材料可通過控制厚度來提高電極的抗污染性能，但電極在活體實(shí)驗(yàn)后靈敏度仍然有較大的變化，仍需對電極進(jìn)行活體后的校正。
為了克服微電極必須在活體后校準(zhǔn)的缺點(diǎn)，Liu等提出了用BSA處理微電極的方法進(jìn)行活體原位分析，因他們發(fā)現(xiàn)微電極在BSA溶液中，電極的靈敏度會迅速降低，但BSA的濃度大于30 mg/mL時(shí)，電極的靈敏度不再下降，即使電極在與BSA電荷相反的蛋白質(zhì)溶液中，電流響應(yīng)也很穩(wěn)定?；诖?，他們在活體檢測前用40 mg/mL BSA處理微電極，結(jié)果表明，活體前校準(zhǔn)曲線的靈敏度和活體后校準(zhǔn)曲線的靈敏度一致。并且，用BSA處理檢測多巴胺（DA）的CFE和檢測抗壞血酸（AA）的碳納米管修飾CFE，發(fā)現(xiàn)這兩種電極在活體前和活體后的校準(zhǔn)曲線都是一致的，這說明了BSA處理的方法具有很好的普適性。該方法為活體電化學(xué)方法提供了可靠且簡單的電極前校準(zhǔn)的策略（圖6）。
在提高微電極的抗蛋白吸附能力的同時(shí)保持微電極的靈敏度對活體檢測極其重要，Liu等進(jìn)一步設(shè)計(jì)了聚合物單體EDOT PC（兩性離子磷酸膽堿官能化的乙烯二氧噻吩），并通過電化學(xué)聚合法將其可控地聚合在微電極表面，形成了具有類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的PEDOT PC超薄膜。其中由于PC端的電化學(xué)聚合自限制，形成了非常薄的PEDOT PC膜，保證了待檢測物在膜內(nèi)的快速傳質(zhì)。因此，PEDOT PC修飾的微電極不僅能夠有效地抗蛋白質(zhì)的非特異性吸附，而且能保持電極的檢測靈敏度。利用PEDOT PC修飾的CFE準(zhǔn)確監(jiān)測了大鼠腦內(nèi)KCl刺激，以及電刺激過程中DA的釋放。該研究有效解決了微電極在活體原位分析中蛋白質(zhì)吸附的關(guān)鍵問題，為更好地研究腦神經(jīng)化學(xué)的分子機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)（圖7）。
在微電極的表面構(gòu)筑特殊結(jié)構(gòu)也是有效克服蛋白質(zhì)吸附造成分析性能下降的有效途徑。Zhou等在CFE表面構(gòu)筑了一個(gè)高孔隙率的、有序的二氧化硅抗污染薄膜（SNM）。SNM能夠有效地防止蛋白質(zhì)進(jìn)入到通道中引起CFE電極表面的生物污染，同時(shí)對O2的擴(kuò)散具有高滲透性?；铙w實(shí)驗(yàn)表明：SNM/CFE可連續(xù)監(jiān)測O2且能夠保持對其高的分析靈敏度和快速響應(yīng)。為了能夠在構(gòu)筑多孔結(jié)構(gòu)的同時(shí)又具有高的親水性能，F(xiàn)eng等報(bào)道了一種聚單寧酸（PTA）摻雜的納米多孔導(dǎo)電聚苯胺（PANI）膜涂層，其中PANI構(gòu)筑了多孔的結(jié)構(gòu)，PTA的摻雜不僅使得PANI在中性溶液中保持了導(dǎo)電能力，而且PTA的多羥基使得構(gòu)筑的PTA PANI多孔膜親水性能更強(qiáng)，并對DA具有很強(qiáng)的富集能力。所制備的PTA PANI修飾的CFE表現(xiàn)出高的抗蛋白吸附的能力，活體前和活體后DA的校準(zhǔn)曲線靈敏度基本一致，并且活體檢測DA的釋放具有高的穩(wěn)定性（圖8）。
在電化學(xué)分析中，蛋白質(zhì)吸附對不同信號輸出方式的影響不同，因此所使用的抗蛋白質(zhì)吸附的方法也不同。Hao等發(fā)展了一種具有高抗蛋白質(zhì)吸附性能的電位型傳感器可用于直接監(jiān)測鼠腦中pH的變化。該電極通過使用H+選擇性膜（H+ISM）和含有增塑劑雙（2乙基己基）癸二酸酯，H+離子載體三癸胺和離子交換劑鉀四（4氯苯基）的聚氯乙烯聚合物基質(zhì)制備。體外和體內(nèi)研究均表明，CF H+ISEs電極具有很強(qiáng)的抗蛋白質(zhì)吸附性能，CF H+ISE能夠在活體檢測后保持和活體前相同的靈敏度和可逆性（圖9）。
此外，使用紅細(xì)胞膜修飾Ag/AgCl設(shè)計(jì)的參比電極也表現(xiàn)出優(yōu)異的抗蛋白質(zhì)吸附的性能，在活體內(nèi)能提供穩(wěn)定的電位并減小對組織的損傷。
5結(jié)論
在活體電化學(xué)分析中，微電極抗蛋白質(zhì)吸附層的設(shè)計(jì)對提高活體檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，以及正確理解大腦功能的分子機(jī)制，都具有十分重要的意義。雖然在宏觀電極上，目前有很多抗污染的方法可實(shí)現(xiàn)抗蛋白質(zhì)的吸附，并能實(shí)現(xiàn)部分復(fù)雜樣品，如血液等中的物質(zhì)的分析，活體內(nèi)通過電極界面設(shè)計(jì)也實(shí)現(xiàn)了部分物質(zhì)的短時(shí)間實(shí)時(shí)分析，但活體分析抗蛋白質(zhì)的吸附仍然存在很大的挑戰(zhàn)。這主要是因?yàn)椋海?）在宏觀電極上可實(shí)現(xiàn)的策略，很難在微電極上實(shí)現(xiàn)，如表面微結(jié)構(gòu)的調(diào)控，表面修飾等，因微電極表面需要更苛刻的合成條件和原位可控修飾技術(shù);（2）抗蛋白質(zhì)吸附策略物質(zhì)依賴性強(qiáng)，不同信號讀出方式，信號轉(zhuǎn)換方式的抗蛋白質(zhì)吸附策略也不一樣，需依據(jù)不同信號讀出方式（如電流法、電位法、電阻法等）和不同轉(zhuǎn)換方式（如酶、適配體等）設(shè)計(jì)不同的抗蛋白質(zhì)吸附的策略;（3）活體長期檢測需要抗蛋白質(zhì)膜具有更高的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性。相信，隨著各學(xué)科的發(fā)展，如材料科學(xué)、微納制備技術(shù)、信號轉(zhuǎn)換和讀出模式等，能更好地解決微電極的蛋白質(zhì)吸附的問題，實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的準(zhǔn)確分析，更好地揭示腦神經(jīng)科學(xué)的化學(xué)本質(zhì)。
