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3電極抗蛋白質(zhì)吸附的策略
蛋白質(zhì)的非特異性吸附過程非常復(fù)雜，一般認(rèn)為是由于蛋白質(zhì)和電極表面強(qiáng)的相互作用引起的。這種相互作用主要包括靜電吸引/排斥相互作用、疏水/親水相互作用、氫鍵和偶極相互作用。研究表明：吸附過程一般不是由單一的某種相互作用決定的，而是由這些相互作用協(xié)同完成的。由于在水體系中，蛋白質(zhì)吸附時(shí)其疏水相互作用的強(qiáng)度更大，所以許多減少表面蛋白質(zhì)非特異性吸附的主要策略是增加電極表面的親水性。近年來，研究人員使用一系列抗蛋白質(zhì)吸附的方法和策略，如調(diào)控特殊的電極表面形貌和使用涂層修飾電極表面等方法，旨在減少蛋白質(zhì)在電極表面的非特異性吸附，從而提高電極對(duì)待檢測(cè)物檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
3.1構(gòu)筑特殊結(jié)構(gòu)的電極表面
目前，特殊表面形貌的構(gòu)筑主要集中在多孔電極的制備，因多孔結(jié)構(gòu)能夠增加電極的孔隙率和表面積、暴露更多的電化學(xué)活性位點(diǎn)、以及阻止蛋白質(zhì)到達(dá)孔電極內(nèi)表面，從而降低蛋白質(zhì)吸附對(duì)電極靈敏度造成的不利影響。Collinson研究組制備了不同大小孔徑的金電極，分別使用鐵氰化鉀、六氨合釕、二茂鐵甲醇作為電化學(xué)探針，研究了不同孔徑對(duì)蛋白質(zhì)非特異性吸附的影響。他們發(fā)現(xiàn)具有納米孔的金電極在2 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）溶液中浸泡1 h后，電極的靈敏度未發(fā)生明顯變化。相比之下，金盤電極、大孔和分級(jí)孔的金電極的電流響應(yīng)大幅度降低（圖3A）。納米孔電極提高抗蛋白質(zhì)吸附性能主要是因蛋白質(zhì)能夠吸附到納米孔金電極表面，但無法擴(kuò)散到孔結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面，但分子量較小的探針可擴(kuò)散到納米孔結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面而發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而在宏觀上減少蛋白質(zhì)吸附對(duì)納米多孔金電極電化學(xué)性能的不利影響。該研究組通過脫合金方法制備了抗蛋白質(zhì)吸附的納米多孔金電極，在BSA存在的情況下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)抗壞血酸（AA）和尿酸（UA）的同時(shí)檢測(cè)。Daggumati等用DNA探針修飾納米多孔金電極，在胎牛血清（FBS）和BSA存在的情況下檢測(cè)了DNA分子，他們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的吸附導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)僅降低了5%，表明納米孔電極能有效提高抗蛋白質(zhì)吸附的性能。
Sun等制備了孔道內(nèi)含有表面活性劑的超薄等孔徑二氧化硅膜(SNM)，將其應(yīng)用于電化學(xué)傳感器的抗蛋白質(zhì)吸附。該電化學(xué)傳感器可直接檢測(cè)全血(無需預(yù)處理)中的藥物，并表現(xiàn)出優(yōu)異的抗蛋白質(zhì)吸附能力。這主要是由于:(1)直徑約2.3 nm的超小型通道的尺寸篩分能力，它只允許小的親脂性/中性待測(cè)物滲透到SNM中并富集，隨后被電極檢測(cè)到;而大的、帶電的和親水性物質(zhì)不能通過孔道到達(dá)電極表面;(2)高密度的、規(guī)則的、垂直排列的通道具有的高滲透性和低阻抗效應(yīng)，保證了物質(zhì)的傳遞和電子轉(zhuǎn)移(圖3B)。
除此之外，蛋白質(zhì)在不同形貌、不同粗糙度的電極表面的吸附性能也有所差異。通常，電極表面結(jié)構(gòu)的變化(粗糙度)會(huì)加強(qiáng)其表面的親水性或者疏水性。Narasimhan等利用兩種不混溶聚合物(聚甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯)之間的相分離，在基底上形成了具有不同長(zhǎng)徑比的Si3N4陣列。他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)Si3N4長(zhǎng)徑比為0.45時(shí)，該Si3N4膜表面顯示出較小的水接觸角，他們將該膜作為光機(jī)械傳感元件，開發(fā)了一種微型植入式的長(zhǎng)期眼內(nèi)壓(IOP)傳感器，傳感器表現(xiàn)出優(yōu)異的抗蛋白質(zhì)吸附和抗炎癥性能。
3.2電極表面涂層修飾
親水性表面能夠與水分子結(jié)合形成水合層，阻止蛋白質(zhì)的非特異性吸附。目前，用于電極表面修飾增加電極表面親水性的材料包括聚乙二醇(PEG)，兩性離子材料，仿生材料和合成肽等。Nafion，BSA，牽連蛋白，堿處理的醋酸纖維、殼聚糖和PEDOT:Nafion等也被用于抗蛋白質(zhì)吸附材料。通常，抗蛋白吸附材料通常遵從Whitesides規(guī)則:(1)存在極性官能團(tuán);(2)存在氫鍵受體;(3)不存在氫鍵給體;(4)呈電中性。
PEG是一種無毒、高親水的生物相容性聚合物，被廣泛用于減少蛋白質(zhì)的非特異性吸附。其抗蛋白質(zhì)吸附性能主要?dú)w因于表面的水合作用和空間位阻效應(yīng)。其中，PEG表面填充密度和聚合物鏈長(zhǎng)度均會(huì)影響PEG防污性能。填充密度越大和鏈越長(zhǎng)在一定程度上會(huì)增強(qiáng)表面防污能力。目前，PEG的表面功能化有兩種方法:(1)通過將制備的PEG吸附到表面上;(2)通過表面引發(fā)基團(tuán)原位生長(zhǎng)PEG。其中，PEG自發(fā)的自組裝可獲得高的表面覆蓋度。Luo研究組將PEG和三磷酸腺苷(ATP)適配體自組裝在聚多巴胺(PDA)修飾的電極表面，開發(fā)了一種高靈敏、抗蛋白質(zhì)吸附的ATP傳感器。該傳感器表面能顯著降低蛋白質(zhì)的非特異性吸附，以及蛋白質(zhì)對(duì)電子(電荷)轉(zhuǎn)移造成的影響。該研究組進(jìn)一步報(bào)道了用于檢測(cè)人血清中乳腺癌易感基因(BRCA1)的PEG化聚苯胺(PANI/PEG)納米纖維修飾玻碳電極(GCE)的傳感器。該傳感器在未稀釋的人血清中孵育后，生物傳感器保留了92.17%的初始電流。盡管PEG作為抗蛋白質(zhì)吸附材料具有很強(qiáng)的吸引力，但對(duì)長(zhǎng)期應(yīng)用來說，抗蛋白質(zhì)吸附能力會(huì)受到PEG聚醚結(jié)構(gòu)和末端羥基易受氧化和熱降解的限制。此外，長(zhǎng)鏈PEG防污非導(dǎo)電聚合物的接枝可形成具有高阻抗的電極涂層，也會(huì)導(dǎo)致電極靈敏度的降低。兩性離子聚合物作為具有正電荷和負(fù)電荷官能團(tuán)的電中性材料，由于其強(qiáng)偶極子和靜電相互作用，可形成具有氫鍵和離子溶劑化穩(wěn)定的、致密的水合層，因此兩性離子聚合物表現(xiàn)出比其它親水/疏水材料(如PEG)更優(yōu)異的抗蛋白質(zhì)吸附特性。
目前，兩性離子抗蛋白質(zhì)材料可分為3種類型:磷酸膽堿(PC)，磺基甜菜堿(SB)和羧基甜菜堿(CB)。這些兩性離子聚合物具有良好的穩(wěn)定性和低成本等優(yōu)點(diǎn)，有望替代目前商品化使用最多的PEG，應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器和可植入性電極中?；赑C或者PC衍生物的自組裝膜均表現(xiàn)出優(yōu)異的抗蛋白質(zhì)吸附的性能和良好的電化學(xué)穩(wěn)定性，其性能優(yōu)于基于苯基PEG的自組裝膜(SAM)。Goda等通過邁克爾型加成反應(yīng)，將2鄄甲基丙烯酰氧基乙基磷酸膽堿(MPC)連接到鏈烷二硫醇中的一個(gè)巰基，得到一個(gè)自組裝單層PC膜，該膜表現(xiàn)出優(yōu)異的抗蛋白質(zhì)吸附性能。Li等用磷脂酰膽堿(PC)自組裝單層膜構(gòu)筑了電化學(xué)適配體生物傳感器。PC自組裝膜中PC鏈比較短，不僅可能保證傳感器的電子轉(zhuǎn)移，而且能夠有效阻止蛋白質(zhì)或細(xì)胞在電極表面上的非特異性吸附，從而提高了傳感器在全血中的分析性能。在流動(dòng)體系中，檢測(cè)全血12 h后基線漂移僅為10%，而未使用PC構(gòu)筑的傳感器降低了70%(圖4)。
受這些天然膜分子抗蛋白質(zhì)吸附性能的啟發(fā)，研究者合成了多種兩性離子聚合物，如SB、CB，或其類似結(jié)構(gòu)的材料，其中SB和CB已被廣泛用于各種抗蛋白質(zhì)吸附表面的修飾。Wu等使用一步電聚合法制備了基于兩性離子聚(磺基甜菜堿鄄3，4鄄亞乙二氧基噻吩)(PSBEDOT)鄄葡萄糖氧化酶(GOx)的葡萄糖傳感器。結(jié)果表明，該兩性離子膜具有優(yōu)異的抗纖維蛋白原和血漿蛋白質(zhì)吸附的性能(圖5)。Hu等采用電化學(xué)介導(dǎo)的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合，在酶電極表面聚合兩性離子磺基甜菜堿甲基丙烯酸酯單體，在未稀釋的牛血清中浸泡15 d后，該電極減少了超過99%蛋白質(zhì)的非特異性吸附，并且其靈敏度在15 d后仍保持在94%以上，而裸電極的靈敏度僅保留了約5%。Sun等報(bào)道了一種通過仿生甜菜堿化合物用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的抗蛋白質(zhì)非特異性吸附的微陣列電極。微陣列電極通過豐富的羧基和兩性離子聚合物修飾，有效捕獲抗體，防止了其它蛋白質(zhì)的非特異性吸附。
Montiel等提出了使用暫態(tài)聚合物涂層修飾電極表面，即在特定的時(shí)間內(nèi)溶解。這種暫態(tài)聚合物可通過調(diào)節(jié)涂層的特性(密度和厚度)調(diào)控溶解的速度，如2、4和6 h等，從而制備了在復(fù)雜樣品中可延遲暴露新鮮電極表面的多電極生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)未經(jīng)處理的血液和唾液樣本長(zhǎng)時(shí)間的直接血糖監(jiān)測(cè)。這種延遲傳感器雖然可調(diào)控材料的組成，刺激分解的條件來實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品中某一時(shí)間的響應(yīng)，但因新鮮的電極表面暴露在含蛋白質(zhì)的樣品中，仍會(huì)迅速被蛋白質(zhì)吸附，因此不能用于長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)檢測(cè)。
