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3結(jié)果與討論
3.1環(huán)盤微電極的制備與表征
圖1A為環(huán)盤電極的制備過程圖，中間為CFdisk電極，并被拉制的玻璃毛細(xì)管包被，玻璃管外壁利用濺射的方法鍍一層Au膜，為了形成納米Auring電極，側(cè)壁用石蠟絕緣。所制備的環(huán)盤電極電鏡表征圖如圖1C和1D所示，整個電極的外徑約為40μm，CFdisk電極的直徑約為7μm，納米Auring的厚度約為350 nm。此外，在挑選的毛細(xì)管玻璃壁厚度和拉制儀溫度下，CFdisk和Auring電極之間玻璃管的厚度約為10μm。
圖2為環(huán)盤電極、CFdisk電極和Auring電極在5 mmol/LRu（NH3）6Cl3溶液中的循環(huán)伏安圖。如圖2實線所示，在0.5～+0.1 V的電位范圍內(nèi)，環(huán)盤電極中的CFdisk和Auring電極單獨(dú)施加電位時，兩個電極的循環(huán)伏安圖為典型的穩(wěn)態(tài)伏安曲線，
說明CFdisk和Auring均具有微電極的特征。為了考察CFdiskAuring電極中CFdisk電極和Auring電極之間是否存在擴(kuò)散層交蓋，并且可獨(dú)立工作，使用兩通道，將CFdiskAuring環(huán)盤電極中的兩個電極同時施加電位，如圖2虛線所示，CFdisk和Auring的循環(huán)伏安圖也為穩(wěn)態(tài)曲線，并且兩個電極的電流大小和分別施加電位的圖相同，說明兩個電極之間未擴(kuò)散層交蓋。上述研究結(jié)果說明，此電極可用于兩組分的同時檢測。
3.2環(huán)盤電極對H2O2和DA的電化學(xué)響應(yīng)
如前所述，利用Auring電極檢測電刺激DA的釋放，并通過電化學(xué)沉積的方法，將對H2O2有選擇性催化的PB沉積在中間CFdisk電極上。H2O2雖然具有電化學(xué)活性，但是在一般電極上氧化還原過電位很大，氧化電位高于+0.6 V，還原電位低于
0.5 V，而PB在中性溶液中容易結(jié)構(gòu)坍塌，因此用電聚合的方法將導(dǎo)電聚合物PEDOT原位聚合在PB/CFdisk電極上，用以保持PB在中性溶液的穩(wěn)定性。圖3為所制備的電極對H2O2和DA在中性溶液中的電化學(xué)響應(yīng)圖。PB/CFdisk電極修飾PEDOT前后循環(huán)掃描25圈的穩(wěn)定性圖如圖3A和圖3B所示，PB/CFdisk電極在+0.18 V有一對可逆的PB的氧化還原峰，氧化還原峰電流在循環(huán)掃描的過程中，因為PB在中性溶液中不穩(wěn)定，電流逐漸減小，而經(jīng)過PEDOT保護(hù)的PB/CFdisk電極，PB的氧化還原峰電流并未明顯的降低，說明PEDOT對PB具有很好的保護(hù)作用。當(dāng)在中性PBS中加入300μmol/L H2O2時，PB的氧化峰電流減小，還原峰電流增加（圖3C），說明PB對H2O2具有良好的催化作用。DA在Auring電極上的電化學(xué)行為（圖3D）表明，DA在+0.18 V處氧化電流到達(dá)穩(wěn)態(tài)，說明DA在Auring電極上有很好的電化學(xué)響應(yīng)。
圖3 PB/CFdisk電極在電聚合PEDOT（A）前和（B）后在PBS溶液中的循環(huán)掃描（CV）圖，掃速50 mV/s;（C）PEDOT/PB/CFdisk電極在PBS中加入300μmol/L H2O2前（a）、后（b）的CV圖，掃速5 mV/s;（D）Auring電極在PBS中加入100μmol/L DA前（a）、后（b）的CV圖，掃速50 mV/s
3.3環(huán)盤電極對H2O2和DA的電化學(xué)分析
為了避免環(huán)盤電極上H2O2和DA的相互干擾，本研究選擇PEDOT/PB/CFdisk電極對H2O2的檢測電位為0.05 V。首先考察了PEDOT/PB/CFdisk電極和Auring電極對H2O2和DA檢測的線性和靈敏度，結(jié)果如圖4所示。由圖4A可見，在0.05 V電位下，在PBS溶液中連續(xù)加入一定濃度的H2O2時，PEDOT/PB/CFdisk電極具有良好的電流響應(yīng)，H2O2濃度在1～29μmol/L范圍內(nèi)，電流響應(yīng)與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（I（pA）=27.67-4.37CH2O2（μmol/L），R=0.98），檢出限為0.4μmol/L（S/N=3）。Auring電極對DA也具有良好的響應(yīng)，DA濃度在0.5～25μmol/L，其電流響應(yīng)值與DA濃度呈良好的線性關(guān)系（I（nA）=0.40（nA）+0.45CDA（μmol/L），R=0.99），檢出限為0.18μmol/L（S/N=3）。
進(jìn)一步考察了環(huán)盤電極之間是否存在交叉干擾，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)PBS溶液中加入20μmol/L H2O2后，Auring電極上未出現(xiàn)明顯的電流變化，而PEDOT/PB/CFdisk電極上的電流則明顯下降。加入圖4（A）在PBS溶液中連續(xù)加入一定濃度的H2O2后PEDOT/PB/CFdisk電極的電流響應(yīng)圖。電位：0.05 Vvs.Ag/AgCl;（B）從圖（A）中獲取的電流信號值與H2O2濃度的線性關(guān)系;（C）在PBS中連續(xù)加入一定濃度的DA后Auring電極的電流響應(yīng)及（D）從圖（C）中獲取的電流信號值與DA濃度的線性關(guān)系，電位：+0.3 V vs.Ag/AgClDA后，Au ring電極的電流出現(xiàn)了明顯增加，而PEDOT/PB/CFdisk電極的電流未明顯變化。
這些結(jié)果表明，PEDOT/PB/CFdiskAuring電極兩個通道之間未交叉干擾，因此可用于MFB NAc腦區(qū)中H2O2和DA的同時檢測。
利用計時電流法檢測時，電極的穩(wěn)定性也是活體分析要考慮的重點(diǎn)問題。如圖6A所示，在2000 s內(nèi)，PEDOT/PB/CFdisk電極能保持良好的穩(wěn)定性。本研究采用濺射成膜方式形成的Auring電極，檢測DA在2000 s內(nèi)同樣擁有良好的穩(wěn)定性，這與文獻(xiàn)[30]報道的金電極對DA檢測具有良好的穩(wěn)定性一致。
3.4鼠腦內(nèi)的H2O2和DA的活體檢測
為了證明Auring電極能夠用于實時監(jiān)測活體內(nèi)DA的變化，將環(huán)盤電極植入到SD大鼠的NAc腦圖6（A）在PBS溶液中加入10μmol/L H2O2后的PEDOT/PB/CFdisk電極的電流響應(yīng)圖。電位：-0.05 V vs.Ag/AgCl;（B）在PBS溶液中加入10μmol/L DA后的Auring電極的電流響應(yīng)圖。電位：+0.3 Vvs.Ag/AgCl區(qū)，并在MFB區(qū)域用雙極電極進(jìn)行電刺激（60 Hz，±300μA，3 s）。如圖7A所示，在刺激后，Auring電極上記錄到短暫的脈沖式電流變化，
這種釋放模式與文獻(xiàn)報道一致。但是，在刺激下未觀察到H2O2濃度變化。為了考察PB/PEDOT/CFdisk電極能對H2O2具有響應(yīng)，利用微灌注的方式，在微電極附近灌注H2O2（10 mmol/L），結(jié)果如圖7B所示，灌注H2O2 100 s后，電流逐漸下降，并達(dá)到峰值;停止灌注后，電流又恢復(fù)到基線值，說明PB/PEDOT/CFdisk電極對在活體內(nèi)對H2O2也具有良好的響應(yīng)。
4結(jié)論
制備了用于H2O2和DA檢測的環(huán)盤微電極，此電極對H2O2和DA均有良好的電流響應(yīng)和穩(wěn)定性。PEDOT/PB/CFdisk電極和Auring電極之間未交叉干擾，可檢測活體內(nèi)H2O2和DA濃度的變化。雖然在電刺激的過程中未觀察到二者濃度同時變化，但此方法可用于其它的生理或者病理過程中有關(guān)H2O2和DA濃度的變化，并促進(jìn)與之相關(guān)的生理和病理的研究。
