摘要在腦神經(jīng)系統(tǒng)中，過氧化氫（H2O2）和多巴胺（DA）的同時分析具有重要的意義，但二者的同時實時分析具有很大的挑戰(zhàn)。本研究制備了可用于二者同時電化學分析的環(huán)盤微電極，中間的碳纖維盤（CFdisk）電極通過電化學沉積選擇性地修飾普魯士藍（PB），并電聚合聚3，4乙烯二氧噻吩（PEDOT）保護PB，檢測H2O2，金環(huán)（Auring）電極檢測DA。研究結果表明，此電極對H2O2的線性檢測范圍為1～29μmol/L，檢出限為0.4μmol/L;對DA的線性檢測范圍為0.5～25μmol/L，檢出限為0.18μmol/L，兩電極之間未交叉干擾。采用此電極檢測了大鼠腦內(nèi)的DA和H2O2濃度的變化。本研究為有關H2O2和DA的神經(jīng)生理和病理的研究提供了新的方法。

1、引言

過氧化氫（H2O2）是腦神經(jīng)系統(tǒng)中重要的調(diào)質(zhì)。一方面，H2O2是活性氧物質(zhì)（ROS）之一[1，2]，濃度過高會引起大范圍細胞損傷，與帕金森綜合癥等疾病密切相關[3，4];另一方面，越來越多的研究表明，H2O2是信號分子[1，5]，不僅是細胞生長和細胞器功能的調(diào)節(jié)者，也是神經(jīng)元之間、神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞間的擴散性信使分子[6]，并且在突觸傳導和可塑性方面也有著重要作用[7]。如神經(jīng)元中多巴胺（DA）和6羥基多巴胺（6 OHDA）的氧化產(chǎn)生H2O2，可調(diào)節(jié)神經(jīng)元生理狀態(tài)[8，9]，在紋狀體神經(jīng)元中，谷氨酸激活α氨基3羥基5甲基4異惡唑丙酸受體（AMPAR）可在下游產(chǎn)生H2O2，產(chǎn)生的H2O2作為信號分子，通過鉀離子三磷酸腺苷（K ATP）通道抑制軸突釋放DA[10，11]。因此H2O2與DA的同時分析對于了解二者的相互作用具有重要意義。

活體原位電化學分析是將微電極植入特定腦區(qū)，對腦神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的物質(zhì)進行分析的方法[12～20]，因其為時空分辨率高，電極易于微型化、陣列化[21～27]，在腦神經(jīng)科學中的應用越來越多。但是腦內(nèi)物質(zhì)多樣，性質(zhì)相近，多種物質(zhì)分析必須克服相互之間的交叉干擾[28，29]，因此建立具有高選擇性的多組分的原位實時電化學分析方法具有很大的挑戰(zhàn)。本研究設計了一個可同時檢測兩組分的微電極，如圖1所示，中間為碳纖維盤（CFdisk），外周為納米金環(huán)（Auring），以H2O2和DA為例，在CFdisk電極上修飾普魯士藍選擇性分析H2O2，Auring電極檢測DA。本研究結果有助于更深入研究腦神經(jīng)系統(tǒng)中H2O2和DA的生理功能和二者的相互關系。

2驗部分

2.1儀器與試劑

CHI760D電化學工作站（;三電極系統(tǒng)：CFdiskAuring電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極;WD 2微電極拉制儀;JPC 200磁控濺射鍍膜機;FE20/EL20型實驗室pH計;JSM 7401F掃描電子顯微鏡。

K3[Fe（CN）6]、FeCl3、NaOH、濃H2SO4（98%）、乙腈（國藥集團化學試劑有限公司）;3，4乙烯二氧噻吩（EDOT）、多巴胺（DA）、H2O2（Sigma公司）;pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液（PBS）由50 mmol/L的KH2PO4 K2HPO4組成;人工腦脊液（aCSF，pH=7.4）由KH2PO4（0.5 mmol/L）、NaHCO3（27.5 mmol/L）、NaCl（126 mmol/L）、KCl（2.4 mmol/L）、CaCl2（1.1 mmol/L）、MgCl2（2.4 mmol/L）和Na2SO4（0.5 mmol/L）組成;所用試劑均為分析純，實驗用水均為去離子水，室溫（25℃）下操作。

2.2實驗方法

2.2.1微電極的制備

微電極的制備如圖1所示，使用微電極拉制儀在820℃的拉制溫度下將玻璃管（i.d.1.5 mm，L=10 cm）拉制成兩個尖端很細的毛細管，拉制完成后，用玻璃刀割開毛細管尖端，控制端口直徑為20～30μm。將碳纖維用導電銀膠連接到銅絲上，小心穿入到上述制備好的毛細管中。用502膠將毛細管兩端封住，放置過夜，使502膠固化，制備成碳纖維電極（CFE）。再將CFE置于磁控濺射鍍膜儀中，在玻璃管外壁鍍金層（約350 nm），取出后用銅絲連接金層，并用蠟封金層絕緣，制成金環(huán)電極。將制備好的CFE Auring電極用2000目砂紙打磨，制成CFdiskAuring電極，超聲，沖洗后備用。

活化CFdiskAuring電極：CFdisk電極在1 mol/L NaOH溶液中+1.5 V電位下活化80 s，然后在0～+1.0 V電位范圍內(nèi)，以50 mV/s的掃速循環(huán)掃描至峰電流穩(wěn)定為止;Auring電極在0.05 mol/LH2SO4溶液中，以50 mV/s的掃速在0.2～+1.8 V電位范圍內(nèi)循環(huán)掃描至峰電流穩(wěn)定為止。電極活化之后，在CFdisk電極上利用恒電流沉積法（電流密度，2μA/cm2），在含有1 mmol/L K3[Fe（CN）6]和1 mmol/L FeCl3的KCl（pH=2，0.1 mol/L）溶液中沉積800 s，獲得普魯士藍（PB）修飾的CFdisk（PB/CFdisk）電極。將PB/CFdisk電極在含10μmol/L EDOT的乙腈和KCl混合溶液中進行循環(huán)伏安掃描2圈，電位范圍是0.1～+1.2 V，掃速為50 mV/s，獲得PEDOT/PB修飾的CFdisk（PEDOT/PB/CFdisk）電極。

2.2.3動物實驗

實驗動物為雄性Sprague Dawley純種大鼠（350～400 g），購于北京大學醫(yī)學部實驗動物中心，于室溫條件下在自然光照周期中自由飲水進食，所有動物實驗過程均遵照國家納米科學中心動物飼養(yǎng)及實驗條例。大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉（345 mg/kg，i.p.），剔除老鼠頭部毛發(fā)，用酒精消毒后，將大鼠頭部固定在立體定位儀上，開顱，去除軟腦膜。將雙極刺激電極植入到內(nèi)前側腦束（MFB）（Ap=2.2 mm，L=1.6 mm，V=7.3 mm），將制備的環(huán)盤微電極植入到伏隔核（NAc）（AP=1.8 mm，L=1.5 mm，V=6.5 mm）。對雙極刺激電極施加頻率60 Hz，±300μA的電刺激信號3 s，刺激NAc腦區(qū)釋放DA。檢測H2O2時，將10 mmol/L H2O2以10μL/min流速注入到NAc區(qū)域，記錄H2O2信號。