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凍害是造成巨大農(nóng)業(yè)損失和植物死亡的主要因素，研究冷凍脅迫對(duì)植物的影響，對(duì)于揭示凍害機(jī)理，尋找抗凍害途徑，減少因低溫和凍害造成的農(nóng)作物損失具有重要意義。目前，有關(guān)冷凍脅迫的研究主要集中在抗寒基因和基因表達(dá)產(chǎn)物、抗氧化防御系統(tǒng)、離子濃度變化和離子流、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等方面。研究表明，冷害會(huì)影響水稻細(xì)胞中抗氧化活性酶的活性，生成活性氧。]對(duì)鷹嘴豆苗進(jìn)行冷凍處理，發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸比率有所增加，CaCAT和CaSOD基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，并生成大量的防御酶。對(duì)水稻進(jìn)行低溫處理后檢測(cè)其根部細(xì)胞的鈣離子(Ca2+)流，發(fā)現(xiàn)胞外的Ca2+會(huì)快速流入細(xì)胞內(nèi)，COLD1基因超表達(dá)，水稻細(xì)胞對(duì)Ca2+的吸收極其強(qiáng)烈，表明COLD1可通過(guò)調(diào)控Ca2+來(lái)激活水稻的抗寒響應(yīng)。
植物細(xì)胞中的Ca2+在抗逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中一直備受人們關(guān)注。當(dāng)細(xì)胞受低溫、高溫和鹽堿等外部刺激時(shí)，早期的細(xì)胞信號(hào)事件幾乎都是Ca2+的變化，影響了細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平平衡，形成鈣信號(hào)被相應(yīng)細(xì)胞器識(shí)別?，F(xiàn)已有大量冷凍脅迫的研究數(shù)據(jù)證明，植物細(xì)胞內(nèi)的Ca2+在感應(yīng)、傳導(dǎo)抗寒信號(hào)和誘導(dǎo)生理響應(yīng)過(guò)程中起著重要的作用。當(dāng)植物受冷凍脅迫時(shí)，Ca2+會(huì)流進(jìn)植物細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)部Ca2+濃度升高，誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)抗寒基因的表達(dá)。Zheng等使用化學(xué)定位法研究了冷凍脅迫下枇杷葉肉細(xì)胞Ca2+分布的變化，發(fā)現(xiàn)冷凍脅迫首先會(huì)誘導(dǎo)Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并在葉綠體膜上聚集，最終進(jìn)入葉綠體。van der Luit等對(duì)低溫脅迫下的煙草幼苗進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)低溫會(huì)使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中Ca2+濃度快速升高，誘導(dǎo)NpCaM-1的表達(dá)。Mori等在擬南芥中發(fā)現(xiàn)低溫會(huì)觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的迅速升高。目前的這些研究大多是檢測(cè)組織、細(xì)胞或細(xì)胞器中Ca2+的分布、濃度變化和離子流來(lái)研究植物在受冷凍脅迫時(shí)的抗逆反應(yīng)。但通過(guò)檢測(cè)冷凍脅迫下原生質(zhì)體破裂產(chǎn)生的Ca2+濃度信號(hào)來(lái)分析其細(xì)胞液中Ca2+分布的研究仍比較少。
在眾多離子中，鈉離子(Na+)的主要生理作用是增加細(xì)胞的滲透勢(shì)。當(dāng)植物吸收大量的Na+后，其胞內(nèi)的電解質(zhì)濃度增加，組成原生質(zhì)體的膠體會(huì)發(fā)生膨脹，從而提高了原生質(zhì)的親水性，增加了細(xì)胞的保水力。低濃度的Na+對(duì)小麥、玉米、大豆、棉花和藻類等植物的生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用。在1979年，Brownell和Crossland就已經(jīng)證實(shí)，Na是C4植物的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如鹽生植物濱藜和白刺，Na元素的缺失會(huì)導(dǎo)致葉片枯黃，生長(zhǎng)延緩。而高濃度的Na+很容易對(duì)植物造成毒害，破壞細(xì)胞膜和使一些蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，影響細(xì)胞的生理活動(dòng)，如細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)、代謝及礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的動(dòng)態(tài)平衡等方面，抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育。目前對(duì)Na+的研究主要集中在植物鹽害和抗鹽性方面，但對(duì)冷凍脅迫下植物細(xì)胞中Na+分布的相關(guān)研究比較少。
近幾年來(lái)，由于納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料逐漸以各種方式滲透到人們的生產(chǎn)生活中。氧化鋅納米粒子(ZnO NPs)由于其獨(dú)特的物理、化學(xué)特性被應(yīng)用到陶瓷、紡織、醫(yī)藥、防曬化妝品和太陽(yáng)能電池等方面。ZnO NPs可以通過(guò)水、土壤和空氣等方式對(duì)人類、動(dòng)物和植物造成影響。當(dāng)前，有關(guān)ZnO NPs對(duì)動(dòng)植物產(chǎn)生負(fù)面影響的報(bào)道比較多。如陳澤林等發(fā)現(xiàn)ZnO NPs對(duì)處于吸脹階段、萌動(dòng)階段和發(fā)芽階段的小麥都有毒性作用。Boonyanitipong等的研究表明，ZnO NPs可以阻礙水稻根生長(zhǎng)，并減少根的數(shù)量。但還有研究表明，ZnO NPs在一定條件下，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有積極作用。Prasad等使用粒徑為25 nm、濃度為1 000 mg·L-1的ZnO NPs處理花生種子，發(fā)現(xiàn)花生幼苗的萌芽和生存能力都得到了顯著的提升。Pavani等報(bào)道稱，ZnO NPs增加了鷹嘴豆新鮮和干燥的重量，促進(jìn)了其芽、根的伸長(zhǎng)。Abdel Latef等研究發(fā)現(xiàn)，ZnO NPs還可以減輕其他類型的非生物脅迫對(duì)植物所造成的影響。使用粒徑為21.3 nm的不同濃度ZnO NPs(20、40和60 mg·L-1)澆灌鹽漬土栽培(150 mmol·L-1NaCl)的羽扇豆，發(fā)現(xiàn)ZnO NPs不但促進(jìn)了光合色素、酚類化合物和抗壞血酸的形成，還增強(qiáng)了超氧化物歧化酶、氧化氫酶和氧化物酶的活性。與未經(jīng)ZnO NPs處理鹽漬土栽培的羽扇豆相比，鹽漬土抑制可其生長(zhǎng)，減少葉綠素的色素沉淀，削弱過(guò)氧化氫酶的活性。但對(duì)于植物冷凍脅迫的研究，目前尚未有研究涉及ZnO NPs在植物受冷凍脅迫中的作用。
使用離子選擇性微電極檢測(cè)蘆薈(Aloevera)原生質(zhì)體破裂時(shí)形成的Ca2+濃度脈沖，同時(shí)檢測(cè)Na+濃度作為對(duì)比，研究了冷凍脅迫對(duì)原生質(zhì)體中Ca2+的分布的影響。并研究了冷凍溫度、解凍時(shí)間和ZnO NPs處理等因素對(duì)冷凍脅迫下蘆薈原生質(zhì)體中離子的分布的影響。
1、材料與方法(Materials and methods)
1.1蘆薈(Aloe vera)細(xì)胞原生質(zhì)體的制備
使用分析天平(XS205DU，精度十萬(wàn)分之一，Switzerland)稱取2.186 g甘露醇(≥80.5%，中國(guó)惠世生化試劑有限公司)、0.222 g二水合氯化鈣(≥98%，西隴化工有限公司)、0.040 g磷酸二氫鉀(≥99.5%，北京化工廠)、0.400 g纖維素酶(U·g-1>15 000，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)和0.280 g果膠酶(1.18 U·mg-1，Sigma Aldrich)放入燒杯中，加入20 mL去離子水，用磁力攪拌器(CL-2，鞏義市予華儀器有限公司)攪拌。再將得到的溶液進(jìn)行離心(DT5-6，北京現(xiàn)代北利離心機(jī)有限公司)，轉(zhuǎn)速2 000 r·min-1，時(shí)間8 min。取其上清液倒入燒杯中，酶解液制備完成。取長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的蘆薈葉片，用去離子水洗凈，把表面水分吸干，切成3 cm的小段，去除葉片表面透明表皮和中間透明膠質(zhì)層后，切成4 mm寬的小條。取4 g左右的葉片，放入盛有20 mL酶解液的燒杯中，用封口膜將燒杯口封住。放入恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWYR-240，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)中，黑暗條件下進(jìn)行酶解，溫度為20℃，轉(zhuǎn)速為60 r·min-1，時(shí)間4 h左右。為促進(jìn)酶解，每隔1 h搖瓶一次。
酶解后得到含有原生質(zhì)體、維管成分和未酶解完全的葉子殘片等的混合液，用200目的網(wǎng)篩過(guò)濾，得到初步純化的蘆薈原生質(zhì)體，靜止放置。為減少酶解液中含有的離子對(duì)后續(xù)測(cè)量的干擾，在測(cè)量前需用無(wú)鈣、無(wú)鈉培養(yǎng)基(濃度為109.3 mg·L-1的甘露醇溶液)清洗原生質(zhì)體。用膠頭滴管吸除原生質(zhì)體上層的酶解液，向其加入20 mL無(wú)鈣、無(wú)鈉培養(yǎng)基，靜置20 min。如此反復(fù)清洗4次，加入20 mL無(wú)鈣、無(wú)鈉培養(yǎng)基，室溫下靜止放置，備用。
1.2離子選擇微電極的制備及表征
1.2.1離子微電極的制備
使用微電極拉制儀(WD-2，成都儀器廠)拉制玻璃微電極，設(shè)置加熱指數(shù)為300，硼硅酸鹽玻璃管(B150-110-10，外徑1.5 mm，內(nèi)徑1.10 mm，長(zhǎng)度10 cm，Sutter Instrument)經(jīng)電阻圈加熱軟化，重錘下拉，得到微電極管。先將微電極管放置在溫度為200℃的干燥箱中(DHG-9140A，鞏義市予華儀器有限公司)，進(jìn)行預(yù)干燥處理1 h。再采取尾端注入法對(duì)微電極管進(jìn)行硅烷化。然后在微電極管中灌充濃度為10-1mg·L-1的CaCl2或NaCl電解液，并在微電極尖端吸入液體離子交換劑。最后插入Ag/AgCl絲作為內(nèi)參比電極，鈣或鈉離子選擇性微電極制備完成。
1.2.2離子選擇性微電極的表征
離子選擇性微電極在使用之前需對(duì)其進(jìn)行性能檢測(cè)，從線性范圍、檢測(cè)下限、響應(yīng)時(shí)間和穩(wěn)定性4個(gè)方面對(duì)所制備的Ca2+、Na+選擇性微電極進(jìn)行了表征，如圖1所示。
由圖1(a)、(b)中可知，Ca2+、Na+選擇性微電極在標(biāo)定液濃度10-1～10-5mol·L-1范圍內(nèi)都有良好的響應(yīng)，回歸系數(shù)分別為0.9991、0.9996，檢測(cè)下限均可達(dá)10-5mol·L-1。圖1(c)為微電極在10-3mol·L-1的標(biāo)定液中，連續(xù)檢測(cè)3 h內(nèi)的電位值，平均電位值分別為-(14.46±0.24)、-(52.44±0.59)mV，穩(wěn)定性都良好。圖1(d)為Ca2+、Na+選擇性微電極在不同濃度標(biāo)定液中的響應(yīng)時(shí)間，分別為(0.550±0.016)、(0.646±0.014)s，都小于1 s，響應(yīng)性能良好。以上情況說(shuō)明，制得的Ca2+、Na+選擇性微電極具有良好的性能，滿足實(shí)驗(yàn)的要求。
1.3 ZnO NPs的表征及懸浮液的配制
1.3.1 ZnO NPs的表征
圖2(a)、(b)分別為ZnO NPs(Sigma Aldrich)的XRD譜和TEM圖。在圖2(a)中，經(jīng)與PDF#36-1415卡片對(duì)照后，發(fā)現(xiàn)測(cè)試譜中的所有衍射峰與標(biāo)準(zhǔn)譜完全一致，說(shuō)明該物質(zhì)為六角纖鋅礦型ZnO，未見(jiàn)其他雜相存在。由圖2(b)可以看出ZnO NPs形狀呈球形，形貌均勻，平均直徑約為20 nm。
1.3.2 ZnO NPs懸浮液的配制
用分析天平稱取0.60、1.00、1.40和1.80 mg的ZnO NP放入燒杯中，分別加入20 mL無(wú)鈣、無(wú)鈉培養(yǎng)基。水浴超聲(KQ-250DB，350 W，昆山市超聲儀器有限公司)10 min，配制成濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1的ZnO NP懸浮液。
1.4蘆薈原生質(zhì)體的冷凍處理
用膠頭滴管吸除原生質(zhì)體層上的培養(yǎng)基，搖晃燒杯，用移液槍吸取原生質(zhì)體向6只培養(yǎng)管中各滴入1 000μL，注入5 mL的無(wú)鈣、無(wú)鈉培養(yǎng)基。其中1只室溫下保存，5只放入冰箱冷凍處理，使其溫度分別降至10℃、0℃、-5℃、-7℃和-10℃，取出后室溫下靜止放置，使已結(jié)冰的培養(yǎng)基完全解凍，溫度恢復(fù)到室溫待用。
1.5用ZnO NPs進(jìn)行預(yù)處理和后處理
預(yù)處理：將蘆薈原生質(zhì)體隨機(jī)分成約等量的4組，每組4份。取其中一組，分別注入5 mL不同濃度的ZnO NPs懸浮液(30、50、70和90 mg·L-1)，放入冰箱冷凍處理，待溫度降至-7℃后取出解凍，使其溫度恢復(fù)到室溫。
后處理：再取一組，分別滴入裝有5 mL的無(wú)鈣、無(wú)鈉培基的培養(yǎng)管中，放入冰箱中冷凍結(jié)冰后取出。靜止放置，待其溫度恢復(fù)到室溫時(shí)，去除上層培養(yǎng)基，注入不同濃度的ZnO NPs懸浮液(30、50、70和90 mg·L-1)各5 mL，處理20 min。
最后取剩余2組，分別加入5 mL的不同濃度ZnO NPs懸浮液，靜止室溫下分別處理3和18 h。
1.6離子脈沖信號(hào)的檢測(cè)
為降低實(shí)驗(yàn)環(huán)境中可能存在的震動(dòng)和電磁輻射對(duì)測(cè)量信號(hào)的干擾，實(shí)驗(yàn)需在金屬屏蔽網(wǎng)中的防震臺(tái)上進(jìn)行。先將Ca2+、Na+選擇性微電極和作為參比的甘汞電極分別固定在三維微操縱儀上，并與微電極放大器(SWF-1D，成都儀器廠)的前級(jí)相連(Ca2+、Na+選擇性微電極分別接到不同的輸入通道)。將樣品池(10 mL無(wú)菌培養(yǎng)皿)放在倒置顯微鏡(CPX41，Olympus)的操作臺(tái)上，將甘汞電極移到距樣品池底部約0.5 cm處，緩慢將Ca2+、Na+選擇性微電極靠近樣品池底部并固定。將倒置顯微鏡調(diào)至4倍物鏡，調(diào)節(jié)三維操縱儀使得2支選擇性微電極在視野中央。再將物鏡切換到10倍，細(xì)調(diào)三維微操縱儀使Ca2+、Na+選擇性微下降至樣品池底部，需保持2只微電極的尖端同時(shí)在視野中。最后用移液槍吸取50μL的待測(cè)原生質(zhì)體，滴入裝有10 mL低滲液(濃度為0.0273 mg·L-1的甘露醇溶液)的培養(yǎng)管中，輕輕搖晃均勻后緩慢倒入樣品池中。保證甘汞電極和Ca2+、Na+選擇性微電極同時(shí)浸沒(méi)在溶液中。通過(guò)顯微鏡在視野中找到一個(gè)原生質(zhì)體作為待測(cè)目標(biāo)，并且視野中應(yīng)沒(méi)有其他原生質(zhì)體存在。將Ca2+、Na+選擇性微電極分別移動(dòng)到目標(biāo)原生質(zhì)體附近，使2支選擇性微電極的尖端盡量靠近該原生質(zhì)體的同一位置。關(guān)閉屏蔽網(wǎng)，生理信號(hào)采集系統(tǒng)(RM6240B，成都儀器廠)開(kāi)始記錄并將信號(hào)顯示在顯示器上。觀測(cè)到原生質(zhì)體破裂的脈沖信號(hào)后，再等待電位恢復(fù)平穩(wěn)停止記錄，保存數(shù)據(jù)。
1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)中從每組原生質(zhì)體中隨機(jī)選取3個(gè)原生質(zhì)體(合計(jì)每組9個(gè)原生質(zhì)體)進(jìn)行離子濃度脈沖測(cè)試，用SPSS 22.0軟件(SSPS Inc.)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。采用ANOVA方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05)。*表示P<0.05，**表示P<0.01。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表述為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
