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2結(jié)果與分析
2.1冷凍對(duì)原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響
圖 3 未經(jīng)冷凍處理(a)與經(jīng)冷凍處理(b)的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)形成的 Ca2+、Na+脈沖信號(hào)
未經(jīng)冷凍和經(jīng)冷凍處理的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)的Ca2+、Na+脈沖信號(hào)(以電極電位表示，下同)如圖3所示。由圖3(a)可知，未經(jīng)冷凍處理的Ca2+、Na+信號(hào)在原生質(zhì)體破裂前電位相對(duì)平穩(wěn)，對(duì)應(yīng)背景離子濃度。當(dāng)原生質(zhì)體開(kāi)始破裂時(shí)，其周?chē)腃a2+濃度明顯上升，直至離子濃度達(dá)到一個(gè)峰值，這段時(shí)間為T(mén)1，計(jì)算得到T1=(11.5±2.2)s。之后隨著Ca2+慢慢向周?chē)鷶U(kuò)散，Ca2+濃度慢慢開(kāi)始下降，直至趨于平穩(wěn)，回復(fù)到背景濃度。整個(gè)過(guò)程結(jié)束后形成了一個(gè)向上的脈沖信號(hào)。這個(gè)脈沖信號(hào)為一個(gè)單一的脈沖，沒(méi)有疊加其他細(xì)節(jié)，表明原生質(zhì)體內(nèi)Ca2+濃度分布比較均勻。Na+濃度脈沖信號(hào)與此類(lèi)似，原生質(zhì)體開(kāi)始破裂到達(dá)到峰值所用時(shí)間為t1，計(jì)算得到t1=(4.0±0.98)s。圖3(b)為經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體破裂時(shí)產(chǎn)生的Ca2+、Na+濃度脈沖信號(hào)。與圖3(a)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍處理后，Ca2+的脈沖信號(hào)發(fā)生了明顯變化。雖然在破裂前Ca2+的濃度仍保持在背景濃度上，但當(dāng)原生質(zhì)體開(kāi)始破裂時(shí)，經(jīng)冷凍處理后的原生質(zhì)體周?chē)腃a2+濃度并未像未經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體那樣快速上升，反而先顯著地下降達(dá)到一個(gè)最低點(diǎn)，緊接著才迅速上升，在Ca2+濃度脈沖的前沿處形成一個(gè)明顯的“凹陷”，從原生質(zhì)體破裂到凹陷恢復(fù)所用時(shí)間為T(mén)2，經(jīng)計(jì)算得到T2=(11.3±1.5)s，形成凹陷的深度為H，計(jì)算得H=(16.9±2.4)mV，從原生質(zhì)體破裂到脈沖最高點(diǎn)所用時(shí)間T1’=(19.8±3.0)s。而經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體的Na+的濃度脈沖信號(hào)則與未經(jīng)處理的原生質(zhì)體破裂時(shí)的離子信號(hào)情況基本相同，沒(méi)有出現(xiàn)前沿凹陷的現(xiàn)象，t1’=(3.9±1.0)s。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍處理后的Ca2+濃度脈沖從原生質(zhì)體破裂開(kāi)始至到達(dá)峰值所有的時(shí)間T1大于未經(jīng)冷凍處理的Ca2+濃度脈沖的相應(yīng)值，兩者間存在顯著差異(P<0.01)，相差約8 s；而Na+濃度脈沖在冷凍前后t1幾乎沒(méi)有變化(二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05)。
經(jīng)冷凍處理后的蘆薈原生質(zhì)體，其破裂時(shí)形成Ca2+濃度脈沖信號(hào)前沿出現(xiàn)顯著的凹陷現(xiàn)象，說(shuō)明原生質(zhì)體中的Ca2+分布不再均勻，靠近細(xì)胞中心濃度較高，而細(xì)胞膜附近濃度較低，產(chǎn)生了分層現(xiàn)象。
原生質(zhì)體在低滲液吸水而膨脹破裂的。由于在這一過(guò)程中有水滲透進(jìn)原生質(zhì)體，如果原生質(zhì)體內(nèi)的Ca2+不能很快擴(kuò)散進(jìn)這些新滲入的水中，則在原生質(zhì)體中靠近細(xì)胞膜處便會(huì)形成一個(gè)Ca2+的低濃度區(qū)，這自然會(huì)使脈沖信號(hào)的前沿處出現(xiàn)一個(gè)與低濃度區(qū)相對(duì)應(yīng)的凹陷。
但從圖3(a)中可知，未經(jīng)冷凍處理蘆薈原生質(zhì)體在破裂時(shí)，其Ca2+濃度脈沖的前沿處并未出現(xiàn)這種凹陷。這說(shuō)明，未經(jīng)冷凍處理的蘆薈原生質(zhì)體內(nèi)的Ca2+能夠很快地?cái)U(kuò)散到滲入原生質(zhì)體內(nèi)的水中，維持了Ca2+濃度的均勻分布。這也表明，未經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體對(duì)其內(nèi)部的Ca2+濃度分布具有很好的調(diào)控能力。
經(jīng)過(guò)冷凍后的蘆薈原生質(zhì)體在破裂時(shí)其Ca2+濃度脈沖信號(hào)前沿處出現(xiàn)了凹陷，表明其中的Ca2+流動(dòng)性變差，或者說(shuō)原生質(zhì)體調(diào)控Ca2+濃度分布的能力遭到了破壞，使得Ca2+不能很快擴(kuò)散到滲入的水中去，造成Ca2+濃度分布不均勻，出現(xiàn)了分層現(xiàn)象。
以往人們?cè)谘芯康蜏孛{迫或細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇時(shí)，大多集中于研究胞外空間的離子流變化或水結(jié)冰時(shí)形成的冰晶對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷，而沒(méi)有注意到細(xì)胞調(diào)控Ca2+分布的能力的變化。趙明明等研究了低溫處理后冬青葉片細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平變化，結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)Ca2+沉淀隨溫度的降低而有所增加。楊蕊等報(bào)道了在4℃下黃楊葉肉細(xì)胞中Ca2+和Ca2+-ATPase的變化，處理3～12 h后細(xì)胞間隙和液泡中的Ca2+沉淀顆粒較少，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的Ca2+增多，Ca2+-ATPase分布幾乎未受影響，處理24 h后，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)Ca2+開(kāi)始轉(zhuǎn)移到細(xì)胞間隙和液泡中，Ca2+-ATPase的活性增強(qiáng)。在2018年，雖然Mori等在文章中提到低溫會(huì)引起擬南芥細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的迅速升高。但這些研究均未提及Ca2+的濃度分布是否出現(xiàn)分層現(xiàn)象。因此，筆者的研究結(jié)果對(duì)于今后這方面的研究具有一定的借鑒意義。與Ca2+不同，Na+在冷凍處理后其濃度分布沒(méi)有發(fā)生分層的現(xiàn)象，這可能與細(xì)胞對(duì)Ca2+和Na+分布的調(diào)控機(jī)制不同，及Ca2+和Na+在細(xì)胞抗冷凍反應(yīng)中的作用有關(guān)，需要作進(jìn)一步的深入研究。
2.2冷凍溫度對(duì)蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響
為了進(jìn)一步研究冷凍溫度對(duì)蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+、Na+濃度分布的影響，將蘆薈原生質(zhì)體冷凍至不同溫度后，研究了其中的Ca2+、Na+濃度分布。
圖4為冷凍至不同溫度的蘆薈原生質(zhì)體，在低滲液中破裂時(shí)的產(chǎn)生的Ca2+、Na+濃度脈沖信號(hào)。(a)～(f)的溫度分別為18℃、10℃、0℃、-5℃、-7℃和-10℃。從圖中可以看出，當(dāng)溫度為18℃、10℃、0℃和-5℃時(shí)Ca2+、Na+的信號(hào)脈沖與未經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體破裂時(shí)的離子信號(hào)基本相同，其信號(hào)前沿處均未出現(xiàn)凹陷。而當(dāng)冷凍至-7℃時(shí)，Ca2+脈沖的前沿部分開(kāi)始出現(xiàn)明顯的“凹陷”，原生質(zhì)體中Ca2+分布發(fā)生了改變。溫度降低到-10℃時(shí)，凹陷依然存在。
使用焦銻酸鈣沉淀的電鏡細(xì)胞化學(xué)方法研究水稻幼苗細(xì)胞經(jīng)1℃處理24、48 h后細(xì)胞中Ca2+定位分布的變化。研究發(fā)現(xiàn)，處理24 h胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)形成了一圈Ca2+沉淀顆粒，當(dāng)處理時(shí)間增加到48 h后，液泡中的Ca2+許多也分布在液泡膜的內(nèi)側(cè)，一部分顆粒趨向靠近液泡膜，而液泡中心部分的Ca2+分布似乎有減少的趨勢(shì)。謝潮添等同樣使用焦銻酸鈣沉淀的電鏡細(xì)胞化學(xué)方法，研究了2℃下的董棕幼苗葉肉細(xì)胞中Ca2+水平及其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，研究表明，未經(jīng)低溫處理的董棕幼苗葉肉細(xì)胞，焦銻酸鈣沉淀顆粒大量出現(xiàn)在液泡和細(xì)胞間隙中。48 h低溫處理后，細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞膜上焦銻酸鈣沉淀增加，葉綠體外膜受損。處理120 h后，焦銻酸鈣沉淀大多分布在胞基質(zhì)和細(xì)胞膜上，較少分布在液泡和核基質(zhì)中。葉綠體、核膜和液泡膜嚴(yán)重破損，內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊。上述研究表明，低溫處理有使Ca2+向細(xì)胞膜附近聚集的趨勢(shì)，這與筆者的發(fā)現(xiàn)似乎剛好相反。不過(guò)，上述研究均使用了焦銻酸鈣沉淀的電鏡細(xì)胞化學(xué)方法，測(cè)量過(guò)程中細(xì)胞中的Ca2+以沉淀方式被析出，而且透射電鏡觀察需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，這些都影響了的Ca2+的流動(dòng)性。而筆者所采用的方法則不需要對(duì)Ca2+進(jìn)行沉淀析出，也不用對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定處理，所得的結(jié)果應(yīng)當(dāng)更接近細(xì)胞內(nèi)Ca2+的真實(shí)分布。
圖4不同冷凍溫度下原生質(zhì)體破裂時(shí)的Ca2+、Na+濃度脈沖圖注：(a)～(f)溫度分別為18℃、10℃、0℃、-5℃、-7℃和-10℃。
有趣的是，在各種不同的溫度下，Na+脈沖信號(hào)的前沿始終沒(méi)有出現(xiàn)凹陷。這說(shuō)明，冷凍脅迫會(huì)對(duì)蘆薈原生質(zhì)體中的Ca2+分布造成影響，但對(duì)Na+分布幾乎沒(méi)有影響。
2.3解凍時(shí)間對(duì)冷凍處理后Ca2+分布的影響
為了研究解凍時(shí)間對(duì)冷凍處理后Ca2+分布的影響，筆者選擇冷凍至-7℃的蘆薈原生質(zhì)體為研究對(duì)象。將其解凍不同時(shí)間后，對(duì)其Ca2+濃度分布進(jìn)行測(cè)量。圖5為蘆薈原生質(zhì)體解凍后1、3和5 h后，其破裂時(shí)產(chǎn)生的Ca2+脈沖信號(hào)的情況?？梢杂^察到經(jīng)冷凍處理后的原生質(zhì)體的Ca2+濃度脈沖前沿處的“凹陷”現(xiàn)象在解凍5 h后依然沒(méi)有消失，原生質(zhì)體中的Ca2+濃度分層的現(xiàn)象依然存在。這說(shuō)明，冷凍造成的原生質(zhì)體內(nèi)Ca2+流動(dòng)的降低，或者說(shuō)原生質(zhì)體對(duì)Ca2+濃度的調(diào)控能力的下降，并不會(huì)在原生質(zhì)體解凍后馬上恢復(fù)，而是會(huì)持續(xù)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。
2.4 ZnO NPs預(yù)處理對(duì)冷凍原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響
圖6為經(jīng)不同濃度ZnO NPs預(yù)處理后再進(jìn)行冷凍(溫度降至-7℃)的蘆薈原生質(zhì)體，在低滲液中破裂時(shí)產(chǎn)生的Ca2+、Na+濃度脈沖信號(hào)。圖中(a)～(d)的ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
由圖6可知，不同濃度ZnO NPs預(yù)處理后原生質(zhì)體破裂時(shí)的Ca2+濃度脈沖曲線(xiàn)在前沿處也都出現(xiàn)了“凹陷”現(xiàn)象。但與未經(jīng)ZnO NPs預(yù)處理的情況相比，經(jīng)處ZnO NPs理后Ca2+濃度脈沖前沿處的凹陷程度都明顯減小，凹陷深度H為(1.5±0.78)mV。明顯小于冷凍脅迫下未加ZnO NPs的凹陷深度(16.9±2.4)mV，相差約為15.4 mV，統(tǒng)計(jì)分析表明二者存在顯著差異(P<0.01)。這說(shuō)明，二者中的Ca2+濃度分布情況有明顯差異，Ca2+濃度分布發(fā)生變化。雖然大量研究都已表明，ZnO NPs對(duì)植物細(xì)胞具毒性，如破壞膜的完整性，DNA鏈斷裂，抑制葉綠素的形成等。但至少?gòu)墓P者的研究結(jié)果來(lái)看，ZnO NPs預(yù)處理對(duì)抵抗冷凍所造成的Ca2+流動(dòng)性下降，維持細(xì)胞對(duì)Ca2+濃度分布的調(diào)控能力方面具有一定的積極作用。與前面的情形一樣，Na+濃度脈沖的形狀仍沒(méi)有明顯的變化，沒(méi)有出現(xiàn)前沿凹陷在現(xiàn)象。
圖5解凍后1 h(a)、3 h(b)和5 h(c)后蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)產(chǎn)生的Ca2+脈沖信號(hào)
圖6不同濃度ZnO NPs預(yù)處理后冷凍脅迫下原生質(zhì)體破裂時(shí)的Ca2+、Na+濃度脈沖圖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
2.5 ZnO NPs對(duì)冷凍后原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響
圖7為蘆薈原生質(zhì)體先經(jīng)冷凍處理(溫度降至-7℃)后，再用不同濃度的ZnO NPs進(jìn)行后處理，最后將其放入低滲液中所測(cè)得的Ca2+、Na+濃度脈沖信號(hào)。
圖7 ZnO NPs處理解凍后原生質(zhì)體破裂后Ca2+、Na+信號(hào)脈沖圖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
由圖中可以看出一個(gè)十分有趣的現(xiàn)象。解凍后再經(jīng)不同濃度ZnO NPs處理的原生質(zhì)體在低滲液中破裂時(shí)，不但Na+濃度脈沖的前沿處沒(méi)有出現(xiàn)凹陷，Ca2+濃度脈沖前沿處的“凹陷”也消失了。這說(shuō)明，ZnO NPs處理使得蘆薈原生質(zhì)體中由于冷凍造成的Ca2+濃度分層消失了，ZnO NPs的加入使得Ca2+濃度分布又發(fā)生了新的變化，造成這一現(xiàn)象的具體原因目前還不是十分清楚。
2.6 ZnO NPs對(duì)未經(jīng)冷凍的蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響
為了進(jìn)一步探究冷凍前后ZnO NPs處理可使?jié)舛让}沖前沿凹陷深度減小甚至消失這一問(wèn)題，了解原生質(zhì)體內(nèi)部Ca2+、Na+濃度分布的變化情況。筆者檢測(cè)了不同濃度ZnO NPs處理3和18 h的未經(jīng)冷凍的蘆薈原生質(zhì)體破裂過(guò)程中產(chǎn)生的Ca2+、Na+濃度脈沖情況，檢測(cè)結(jié)果如圖8和圖9所示。
由圖8可知，當(dāng)ZnO NPs濃度為30、50和70 mg·L-1時(shí)，經(jīng)3 h處理后，蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)產(chǎn)生的Ca2+、Na+信號(hào)中均未出現(xiàn)前沿凹陷的現(xiàn)象。而當(dāng)ZnO NPs濃度為90 mg·L-1時(shí)，發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度脈沖的前沿有輕微的凹陷。另一個(gè)值得注意的現(xiàn)象是，圖8(b)～(d)中，在脈沖上升段的開(kāi)始處，其上升趨勢(shì)更加陡峭。而且，隨著處理時(shí)間的增加，這種趨勢(shì)更加明顯，如圖9所示。
從圖9中可以明顯看出，(a)～(d)中4組脈沖信號(hào)的上升段的開(kāi)始處，脈沖上升速度極快，與其后部分的上升速度有明顯區(qū)別。筆者統(tǒng)計(jì)了未經(jīng)ZnO NPs處理、經(jīng)ZnO NPs分別處理3和18 h的Ca2+濃度脈沖上升部分時(shí)間T1和該部分前1/3處時(shí)間T1/3，如圖10所示。
經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)ZnO NPs處理與ZnO NPs處理的Ca2+濃度脈沖其從原生質(zhì)體破裂到達(dá)到最大值所用的時(shí)間T1基本一致，而在上升的前1/3處所用的時(shí)間T1/3相差明顯。
這一明顯區(qū)別表明，與冷凍造成的原生質(zhì)體內(nèi)靠近細(xì)胞膜處Ca2+濃度下降不同。經(jīng)ZnO NPs處理后的蘆薈原生質(zhì)體中，靠近細(xì)胞膜處的很小范圍內(nèi)，Ca2+濃度有較為明顯的上升趨勢(shì)。這說(shuō)明，Ca2+濃度分布與未經(jīng)ZnO NPs處理時(shí)相比發(fā)生了變化，猜想可能是ZnO NPs使得蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+在細(xì)胞膜附近分布較集中，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂后，在脈沖前沿形成較明顯的濃度變化?？赡苷沁@一現(xiàn)象，使得經(jīng)ZnO NPs預(yù)處理的蘆薈原生質(zhì)體，在冷凍后其Ca2+濃度脈沖前沿處的凹陷變淺；也會(huì)使先冷凍再用ZnO NPs進(jìn)行后處理的蘆薈原生質(zhì)體的Ca2+濃度脈沖前沿凹陷消失。這當(dāng)中的具體機(jī)制值得深入研究。經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的ZnO NPs處理，Na+濃度脈沖的形狀依然沒(méi)有明顯變化，沒(méi)有出現(xiàn)前沿凹陷在現(xiàn)象。
圖8不同濃度的ZnO NPs處理3 h后的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)的Ca2+、Na+濃度脈沖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
圖9不同濃度ZnO NPs處理18 h后的原生質(zhì)體破裂時(shí)的Ca2+、Na+濃度脈沖圖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
圖10未處理、ZnO NPs處理3和18 h的Ca2+濃度脈沖上升部分時(shí)間T1和T1/3
綜上，使用Ca2+離子選擇性微電極檢測(cè)了經(jīng)冷凍處理后的蘆薈原生質(zhì)體在低滲液中破裂時(shí)產(chǎn)生的Ca2+濃度脈沖信號(hào)。研究了冷凍溫度、解凍時(shí)間和ZnO NPs處理等因素對(duì)蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+分布的影響。發(fā)現(xiàn)蘆薈原生質(zhì)體被冷凍至-7℃以下時(shí)，其Ca2+脈沖信號(hào)前沿處發(fā)生明顯的“凹陷”，Ca2+分布出現(xiàn)分層現(xiàn)象?？拷?xì)胞中心濃度較高而細(xì)胞膜附近濃度較低。這說(shuō)明，冷凍造成蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+的流動(dòng)性下降，原生質(zhì)體對(duì)Ca2+濃度分布的調(diào)控能力降低。這一現(xiàn)象在原生質(zhì)體解凍5 h后仍未消失。
經(jīng)過(guò)ZnO NPs預(yù)處理后再進(jìn)行冷凍的原生質(zhì)體，其脈沖凹陷深度明顯減??；而當(dāng)用ZnO NPs對(duì)解凍后的原生質(zhì)體進(jìn)行后處理時(shí)，Ca2+分層現(xiàn)象消失。這可能是由于ZnO NPs處理使得蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+分布趨近于細(xì)胞膜附近導(dǎo)致的。這表明，盡管ZnO NPs對(duì)植物細(xì)胞具有一定的毒性，但其在防止冷凍造成的Ca2+流動(dòng)性下降，維持細(xì)胞Ca2+分布的調(diào)控能力方面，仍然具有一定的積極作用。
