阿爾茨海默病(AD)和缺血是最常見的兩種腦疾病，兩者存在潛在的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，一方面，腦缺血的病人后續(xù)患AD的可能性被大大增強;另一方面，先前患有AD的患者，腦缺血的發(fā)生會進一步加劇認知能力的下降。但是兩種疾病間的病理分子機制的區(qū)別和聯(lián)系尚不清楚，因此發(fā)展對缺血和AD關(guān)聯(lián)性分子的研究，對于探索兩者疾病之間的聯(lián)系，疾病的早期診斷和治療均具有十分重要的研究意義。然而由于腦部微環(huán)境復(fù)雜、體內(nèi)外環(huán)境差異大以及體內(nèi)分子之間相互關(guān)聯(lián)等原因，所以建立高選擇性、高準(zhǔn)確度和多物質(zhì)同時檢測的分析方法仍是一項巨大的挑戰(zhàn)!本課題主要圍繞缺血和AD密切相關(guān)的氯離子及活性硫活體檢測中的選擇性、準(zhǔn)確度等關(guān)鍵科學(xué)問題，設(shè)計和構(gòu)建了系列活體分析新方法，并建立活體分析新方法，成功實現(xiàn)了缺血和AD鼠腦中氯離子和活性硫的活體分析，為其在缺血及AD疾病模型下鼠腦中的分子機制的研究提供了有效的方法。

主要研究內(nèi)容如下:

(1)基于AgNPs可電化學(xué)氧化生成Ag~+，并進一步與Cl~-反應(yīng)生成AgCl的EC反應(yīng)原理，我們以AgNPs的氧化電位作為Cl~-的測定信號，亞甲基藍(MB)作為內(nèi)參比信號，成功制備了一種無標(biāo)記的可實時校準(zhǔn)的電化學(xué)傳感，并用于腦缺血和AD鼠腦模型中Cl~-的實時監(jiān)測。結(jié)果表明該傳感器對Cl~-呈現(xiàn)具有良好的選擇性，不受生物體常見的干擾物的影響，特別是鹵素陰離子的干擾，對Cl~-在1~300 mM濃度范圍內(nèi)具有良好的能斯特響應(yīng)，響應(yīng)靈敏度為58.3 mV/pCl~-。此外，以MB作為電位矯正的內(nèi)參比，可以有效消除測定環(huán)境的差異引起的實驗誤差，顯著提高對Cl~-檢測的準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性與穩(wěn)定性。最后，結(jié)合微電極技術(shù)，我們成功將該傳感器應(yīng)用于AD和缺血兩種腦疾病模型鼠腦中三個腦區(qū)(海馬、紋狀體、皮層)中的Cl~-測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn):AD鼠腦海馬區(qū)Cl~-水平比正常鼠腦偏低(正常組:100±5 mM(n=5);AD組:64±3 mM(n=5))，其他腦區(qū)基本不變。缺血30 min后，紋狀體和海馬中的Cl~-濃度分別下降了19.8±0.5%(n=5)和27.2±0.3%(n=5)，然而皮層中Cl~-濃度并沒有明顯變化。這些結(jié)果為探索Cl~-在腦疾病中的作用提供了有用的數(shù)據(jù)，也為活體分析中其他離子的檢測方法的建立提供了更準(zhǔn)確的分析模式。

(2)設(shè)計并構(gòu)建了一種Turn-on型電化學(xué)生物傳感器用于同時監(jiān)測小鼠腦中的內(nèi)源性H_2S_n和H_2S。首先，借助DFT計算，我們合理設(shè)計并合成了對H_2S_n具有特異性響應(yīng)的新型電化學(xué)探針分子M_(PS-1)和M_(PS-2)，以及特異性識別H_2S的探針分子M_(HS-1)和M_(HS-2)。鑒于良好的可逆性及電化學(xué)信號無交叉干擾的特性，M_(PS-1)和M_(HS-2)被最終選定作為H_2S_n和H_2S的探針分子，并共組裝在具有抗污染特性的介孔金修飾的碳纖維電極表面，構(gòu)筑了可同時檢測H_2S_n和H_2S的電化學(xué)傳感。實驗結(jié)果表明:該傳感器對H_2S_2和H_2S均具有良好的響應(yīng)，分別在0.2-50μM、0.2-40μM范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且同時檢測無交叉干擾。此外，該傳感器具有選擇性高、響應(yīng)時間快和抗污染能力高等優(yōu)點。最后，基于該傳感，我們成功將其用于活體小鼠腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體中以及腦切片中H_2S_n和H_2S的活體檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在鼠腦缺血2 h后及AD模型鼠腦中，H_2S_n的水平均出現(xiàn)升高，而H_2S的水平下降。通過Western-Blot實驗發(fā)現(xiàn):在缺血和AD小鼠腦模型中，TRPA1蛋白的表達與H_2S_n水平變化具有正相關(guān)性。進一步的腦切片實驗表明，在相同量H_2S_n和H_2S的刺激下，H_2S_n激活TRPA1蛋白表達是H_2S的4.4倍。這項研究不僅首次實現(xiàn)了在兩種鼠腦模型中H_2S_n水平的變化分析，而且為深入闡明H_2S_n和H_2S在腦疾病中發(fā)揮的作用提供了新的見解。

(3)基于表面增強拉曼技術(shù)和PCA技術(shù)相結(jié)合，我們構(gòu)建了一種具有高準(zhǔn)確度和高靈敏度的單分子比率型拉曼探針(AuNRs/DEP)，并成功實現(xiàn)對AD鼠腦模型透析液中多種活性硫的檢測。首先，我們合成了具有表面增強拉曼散射功能的金納米棒(AuNRs)。其次，合理設(shè)計并合成了多響應(yīng)探針分子，2-(3，5-二硝基苯氧基)-4-(2-(4-乙炔基苯甲酰氨基)乙基)苯基2-氟-5-硝基苯甲酸酯(DEP)。該分子設(shè)計主要由內(nèi)參比基團和響應(yīng)基團組成，扮有多重識別功能:第一部分為內(nèi)參比乙炔基團，其可與AuNRs通過共價鍵鍵合，將識別分子DEP一步組裝于納米基底表面;與此同時，炔基位于生物體內(nèi)拉曼靜默區(qū)，可以作為內(nèi)參比構(gòu)建比率型探針，提高測定的準(zhǔn)確度。第二部分響應(yīng)基團分別由醚鍵、酯基和C-F鍵組成，分別作為H_2S，H_2S_n，以及H_2S_n和Cys的識別位點。

接著，將DEP分子與AuNRs通過金炔鍵連接，一步制備了AuNRs/DEP的多功能拉曼探針。該探針對不同活性硫物質(zhì)在不同波長處顯示不同的SERS響應(yīng)。通過PCA分析可得，PC1與H_2S、H_2S_n和Cys各自的濃度對數(shù)都具有有良好的線性關(guān)系，并可實現(xiàn)三種物質(zhì)的同時拉曼分析。結(jié)合探針良好的分析性能，最終該AuNRs/DEP拉曼探針成功用于AD鼠腦模型腦透析液中H_2S、H_2S_n和Cys的同時監(jiān)測。