2、納米模擬酶在活性氧檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1超氧陰離子（·）的檢測(cè)

Sadeghian等制備了一種三維納米金網(wǎng)電化學(xué)傳感器（圖3）。多孔金納米網(wǎng)（NPGM）上附著Cyt-c并與工作電極結(jié)合，來(lái)測(cè)量藥物誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞的·通過(guò)多孔膜的釋放速率。該傳感器對(duì)·的靈敏度為7.29 nA/（nmol/L·cm2），最低檢出限為70 pmol/L。該工作通過(guò)改變納米金的的形貌來(lái)增加比表面積，提高了該超氧化物傳感器的電化學(xué)性能。這項(xiàng)工作將為開(kāi)發(fā)高靈敏度的分子電化學(xué)生物傳感器提供了一個(gè)平臺(tái)。

圖3細(xì)胞外超氧化物的電化學(xué)檢測(cè)（a）通過(guò)氧化還原蛋白（Cyt-c）與電極之間的氧化和直接電子轉(zhuǎn)移來(lái)實(shí)現(xiàn)的傳感機(jī)制；（b）細(xì)胞被界面連接功能化電極示意圖

除了上述提到的Au NPs以外，Pt NPs也可作為·的催化劑與石墨烯相結(jié)合作為類(lèi)超氧化物歧化酶。2019年，Hu等通過(guò)電沉積將Pt NPs沉積在三維石墨烯泡沫（3D GF）上構(gòu)建原位檢測(cè)·的三維傳感平臺(tái)。Pt 3D GF具超強(qiáng)的電化學(xué)活性，能使電荷轉(zhuǎn)移電阻降低85%，且3D GF是一個(gè)具有生物相容性的平臺(tái)，有較高的表面積且適合細(xì)胞附著/生長(zhǎng)。該平臺(tái)有明確的表面和界面特性，可實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞中釋放的·的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在3D GF上沉積Pt NPs，減少了帶負(fù)電荷的·和電極表面之間的排斥力，使得3D GF有更高的電子轉(zhuǎn)移速率和更好的電催化活性。

圖4鈷納米復(fù)合材料的制備及其對(duì)·檢測(cè)流程圖

相比于MOFs的不斷改進(jìn)，將磷酸錳與其他生物技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于對(duì)·的電化學(xué)傳感也是一個(gè)較好的方向。Wang等構(gòu)建了一個(gè)基于細(xì)菌纖維素脫氧核糖核酸-磷酸錳（BC DNA-Mn3（PO4）2）的絲網(wǎng)印刷電極的活細(xì)胞傳感界面?；罴?xì)胞被固定在BC DNA-Mn3（PO4）2納米酶?jìng)鞲衅脚_(tái)上，以快速、可靠地檢測(cè)活細(xì)胞釋放的·。該類(lèi)傳感器在小型化、生物相容性、成本低和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方面具有巨大的潛力。這項(xiàng)研究進(jìn)一步表明，現(xiàn)有的構(gòu)建活細(xì)胞傳感界面的方法在未來(lái)的原位檢測(cè)技術(shù)和下一代智能生物芯片、疾病診斷方面具有十分廣闊的前景。

近年來(lái)，研究人員使用電化學(xué)技術(shù)將納米模擬酶與特定的傳感元件結(jié)合用于開(kāi)發(fā)檢測(cè)·的電化學(xué)傳感器。將有機(jī)材料與無(wú)機(jī)材料相結(jié)合用于改善電化學(xué)傳感器的線(xiàn)性范圍窄、檢測(cè)限不夠低等缺點(diǎn)，并提高傳感器對(duì)·的選擇性、穩(wěn)定性。表1展示了用于·檢測(cè)的不同修飾電極的性能比較。

表1用于·檢測(cè)的不同修飾電極的性能比較

2.2羥基自由基（·OH）的檢測(cè)

·OH在高級(jí)氧化過(guò)程（advanced oxidation processes）中作為主要氧化劑降解持久性污染物。但同時(shí)·OH也會(huì)破壞碳水化合物、核酸、脂類(lèi)和氨基酸等生物分子，并對(duì)生物體和人類(lèi)造成極大危害?！H被認(rèn)為是生物系統(tǒng)中產(chǎn)生的最強(qiáng)大的具有潛在危險(xiǎn)的ROS，過(guò)量可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷?！H的濃度也與各種癌癥、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病（如阿爾茨海默病和帕金森?。┯嘘P(guān)，了解·OH濃度與這些疾病之間的關(guān)系有助于更好地診斷和預(yù)防。因此，開(kāi)發(fā)能夠快速分析·OH的靈敏檢測(cè)方法是非常重要的。

Huang等通過(guò)構(gòu)建一個(gè)使用DNA和6-巰基己醇（MCH）的生物傳感器，證明了DNA氧化損傷的程度與·OH的濃度有關(guān)。他們以氮摻雜的多孔碳材料和AuNPs作為信號(hào)放大器，進(jìn)一步提高了電化學(xué)探針的靈敏度和最低檢出限。通過(guò)電化學(xué)探針［Ru（NH3）評(píng)估·OH誘導(dǎo)的DNA損傷。該傳感器具有良好的電導(dǎo)率，其檢測(cè)限為25.0μmol/L。

盡管上述基于DNA的生物傳感器很容易制備，但DNA存在易降解等缺點(diǎn)，這極大地限制了它的實(shí)際應(yīng)用。抗氧化劑被認(rèn)為是防止自由基損傷的還原劑，Abdel-Hamid等將咖啡酸（CAF）作為抗氧化劑，通過(guò)清除自由基來(lái)防止·OH的形成，這可以保護(hù)DNA不被降解。為了研究雙鏈DNA（dsDNA）與咖啡酸（CAF）的相互作用并評(píng)估抗氧化性能，采用多壁碳納米管固定dsDNA并作為玻碳電極修飾材料。在本研究中，同時(shí)研究了·OH對(duì)DNA造成的氧化損傷，并觀察到在加入CAF后，由于其清除·OH的特性，ds-DNA受到保護(hù)。該項(xiàng)工作能夠構(gòu)建生物傳感器用于鑒定DNA損傷，對(duì)癌癥、病毒感染等疾病的預(yù)防具有非常重要的參考意義。

除了通過(guò)直接的DNA氧化損傷程度來(lái)檢測(cè)·OH的濃度外，還可以通過(guò)檢測(cè)其他·OH捕獲物來(lái)間接檢測(cè)和判斷·OH的濃度。Li等將羧基功能化石墨烯（CFG）通過(guò)自組裝單分子膜技術(shù)（SAMs）與乙二胺（NHCH2CH2NH）共價(jià)相互作用固定在玻璃碳電極（GCE）上，得到快速、靈敏檢測(cè)·OH的CFGNHCH2CH2NH/GCE電化學(xué)傳感平臺(tái)。在測(cè)定過(guò)程中，·OH的濃度不是直接獲得的，而是采用4-羥基苯甲酸（4-HBA）作為·OH捕獲物，間接測(cè)得·OH。

Duanghathaipornsuk等提出了一種超靈敏的電化學(xué)傳感器。該傳感器由超小氧化鈰納米團(tuán)簇（＜2 nm）電沉積在絲網(wǎng)印刷碳電極（SPCE）上構(gòu)筑而成。該電化學(xué)傳感器的檢測(cè)限（LOD）為0.6μmol/L。此外，該納米氧化鈰電化學(xué)傳感器在體外成功檢測(cè)到新生小鼠骨組織的成骨細(xì)胞中存在·OH。為了最小化Ce NPs的尺寸，從而最大限度地增加用于·OH清除和檢測(cè)的Ce3+位點(diǎn)的數(shù)量（式（1），（2）為氧化鈰與羥基自由基反應(yīng)原理），該團(tuán)隊(duì)采用表面有機(jī)金屬化學(xué)（SOMC）合成策略來(lái)獲得納米級(jí)的CeOx，通過(guò)控制有機(jī)金屬前體的負(fù)載來(lái)調(diào)整CeOx納米團(tuán)簇的大小和分散性。超靈敏電化學(xué)傳感器有望應(yīng)用于醫(yī)療診斷、燃料電池技術(shù)以及食品和化妝品行業(yè)。

在活性氧檢測(cè)領(lǐng)域，對(duì)·OH的檢測(cè)相對(duì)偏少，這是因?yàn)椤H具有較高的化學(xué)反應(yīng)性，壽命極短（在生物系統(tǒng)中約為15 s），且難以在模型系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)并研究其與DNA損傷的關(guān)系。在眾多研究中Ce NPs對(duì)·OH具有極高的選擇性，這為·OH的檢測(cè)提供了新思路。另外還可以通過(guò)直接判斷DNA的損傷程度來(lái)檢測(cè)·OH濃度或通過(guò)·OH捕獲物間接檢測(cè)·OH。表28，64，66-6展示了用于·OH檢測(cè)的不同修飾電極的性能比較。

表2用于·OH檢測(cè)的不同修飾電極的性能比較

2.3 H2O2的檢測(cè)

H2O2是一種簡(jiǎn)單、重要且功能強(qiáng)大的氧化劑，廣泛應(yīng)用于化工、臨床應(yīng)用、藥物分析、食品制造和環(huán)境保護(hù)等多個(gè)領(lǐng)域。它不僅在化學(xué)和工業(yè)過(guò)程中產(chǎn)生，而且是人體中多種氧化代謝途徑的副產(chǎn)物。為了保證生物功能的正常，H2O2濃度必須低于100 nmol/L，高于此濃度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的氧化應(yīng)激和損傷從而導(dǎo)致嚴(yán)重疾?。ㄈ绨┌Y、糖尿病、阿爾茨海默病和帕金森病等），甚至加速衰老。因此，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)H2O2至關(guān)重要。以下介紹幾種用于檢測(cè)H2O2的電化學(xué)傳感器：

MOFs對(duì)H2O2的氧化表現(xiàn)出獨(dú)特的電催化活性。Sherino等制備了一種以己二酸（adipic acid）為連接劑和哌嗪（piperazine）為載體的鎳金屬有機(jī)材料（APNi-MOF），并將其用作檢測(cè)H2O2的電極材料（AP-Ni-MOF/CPE）。AP-Ni-MOF具有1.28×10－3S·cm－1的高電導(dǎo)率，對(duì)H2O2的檢測(cè)具有很高的電化學(xué)活性。AP-Ni-MOF/CPE檢測(cè)范圍是0.004～60 nmol/L，檢測(cè)限為0.0009 nmol/L。AP-Ni-MOF/CPE電極在H2O2的實(shí)際樣品檢測(cè)（透鏡清潔劑溶液）中表現(xiàn)出了良好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性。Liu等開(kāi)發(fā)了一種新型的卟啉鐵金屬有機(jī)框架（pFeMOF）修飾的有序介孔碳（OMC），用于檢測(cè)活細(xì)胞釋放的H2O2。該pFeMOF/OMC復(fù)合材料是通過(guò)簡(jiǎn)單的一步水熱法制備而成，F(xiàn)e（Ⅲ）離子與卟啉基團(tuán)的羧酸鹽具有很強(qiáng)的配位作用，可以使合成的MOFs更加穩(wěn)定。pFeMOF可以模擬過(guò)氧化物酶特性，獲得良好穩(wěn)定的電化學(xué)信號(hào)。此外，通過(guò)引入了OMC提高pFeMOF的導(dǎo)電率，同時(shí)OMC可以有效地控制pFeMOF晶體生長(zhǎng)。這一策略改善了pFeMOF團(tuán)聚從而使得更多的活性位暴露，提高了該復(fù)合材料的電化學(xué)活性。

在各類(lèi)納米金屬與不同材料相結(jié)合的功能結(jié)合型材料中，除了金屬框架的MOF外，碳基金屬材料的導(dǎo)電性能也非常優(yōu)異。Zhang等將一維金納米粒子（AuNPs）組裝在磁性氮摻雜碳納米管（NCNTs）上，再與細(xì)胞色素c（Cyt-c）結(jié)合制備出基于Cyt-c/NCNTs Fe3O4 Au的傳感器。其引入的AuNPs不僅不會(huì)破壞Cyt-c的天然結(jié)構(gòu)，還能增強(qiáng)Cyt-c在電極表面的電催化特性。該傳感器用于檢測(cè)H2O2，其檢測(cè)限低至0.3μmol/L。

與同為碳基材料的碳納米管相比，石墨烯具有更大的比表面積與穩(wěn)定性，Zhao等報(bào)告了一種快速制備銀納米粒子錨定激光誘導(dǎo)石墨烯（LIG Ag）電極的方法，并用于H2O2檢測(cè)。通過(guò)偏焦激光燒灼方法，銀納米粒子可以均勻分布在具有缺陷和微孔的層狀結(jié)構(gòu)的LIG納米片上，LIG可以抑制銀納米粒子的尺寸增加，同時(shí)銀納米粒子也可以防止石墨烯納米片的團(tuán)聚。Ag NPs和LIG納米片的協(xié)同效應(yīng)使LIG Ag電極在許多方面呈現(xiàn)出優(yōu)異的電化學(xué)性能。該傳感器具有良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性、選擇性，對(duì)H2O2的檢測(cè)限約2.8μmol/L，靈敏度為28.6μA（mmol/L·cm2）。由于LIG Ag電極具有優(yōu)異的導(dǎo)電性、機(jī)械靈活性和輕質(zhì)等特點(diǎn)，該方法為大規(guī)模制造智能傳感設(shè)備提供了一種新思路。

H2O2檢測(cè)已經(jīng)在工業(yè)領(lǐng)域和生物研究中獲得了廣泛的應(yīng)用。在各種H2O2檢測(cè)策略中，電化學(xué)因其高精確度和可靠性、良好的靈敏度和選擇性、低檢測(cè)限、快速反應(yīng)和小型化引起越來(lái)越多的關(guān)注。隨著納米材料的快速發(fā)展，各種納米材料被作為納米模擬酶應(yīng)用于生物傳感領(lǐng)域。表3為用于H2O2檢測(cè)的不同修飾電極的性能比較。

表3用于H2O2檢測(cè)的不同修飾電極的性能比較

3、總結(jié)與展望

納米酶已成為廣泛用于各種領(lǐng)域的熱門(mén)材料。特別是在生物傳感領(lǐng)域，與天然酶相比，納米模擬酶因其獨(dú)特的催化活性，在檢測(cè)活性氧的生物傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用。部分納米模擬酶作為電化學(xué)活性材料對(duì)一些特定的活性氧物質(zhì)具有獨(dú)特的催化性能，受到研究者的廣泛關(guān)注。

隨著與納米模擬酶有關(guān)的研究迅速增加，納米模擬酶應(yīng)用于ROS檢測(cè)的研究也取得了一定的進(jìn)展，但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程種還存在著一些問(wèn)題，具體如下：

（1）目前的研究大多集中在通過(guò)調(diào)節(jié)納米模擬酶的尺寸、形貌和結(jié)構(gòu)來(lái)優(yōu)化納米模擬酶對(duì)ROS的催化性能，對(duì)納米模擬酶中活性位點(diǎn)的研究還很缺乏。

（2）對(duì)納米模擬酶與活性氧的催化機(jī)理的研究還不夠深入，因此了解其催化機(jī)制對(duì)設(shè)計(jì)新型納米酶和調(diào)節(jié)其活性具有重要意義。

（3）納米模擬酶在應(yīng)用過(guò)程中可能會(huì)與細(xì)胞內(nèi)成分如蛋白質(zhì)、核酸和小生物分子等發(fā)生相互作用，而導(dǎo)致其正常的生理功能的破壞。因此，有必要提高納米模擬酶的生物相容性，以開(kāi)發(fā)出新型電化學(xué)生物傳感器，用于原位或?qū)崟r(shí)檢測(cè)ROS。

本文總結(jié)了納米模擬酶在不同種類(lèi)活性氧的電化學(xué)生物傳感器方面的最新進(jìn)展，討論了其在當(dāng)前研究中的不足之處，為今后的研究提供參考。我們期望對(duì)新型的納米模擬酶進(jìn)行進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)，以提高其性能，加快發(fā)展納米模擬酶在ROS檢測(cè)和分析中的應(yīng)用。