奶牛乳腺炎屬于奶牛的一種常見(jiàn)疾病，是制約奶牛健康養(yǎng)殖發(fā)展的重要因素，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。人畜共患的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一。近年來(lái)抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的濫用加劇了金黃色葡萄球菌耐藥菌株的出現(xiàn)和流行，這給奶牛乳腺炎的預(yù)防治療增加了難度和成本，同時(shí)病原菌和抗生素對(duì)奶產(chǎn)品與環(huán)境的污染嚴(yán)重威脅了公共衛(wèi)生安全。研究金黃色葡萄球菌的耐藥機(jī)制和環(huán)境適應(yīng)機(jī)制對(duì)指導(dǎo)抗生素在治療奶牛乳腺炎中的合理使用、遏制耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播具有重要意義。本試驗(yàn)利用基因編輯技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、TEM、q RT-PCR和全基因組測(cè)序技術(shù)等，對(duì)奶牛乳腺炎源金黃色葡萄球菌的耐藥相關(guān)基因進(jìn)行了檢測(cè)和功能分析，并且對(duì)在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)菌表型異質(zhì)亞群進(jìn)行了表型檢測(cè)和表型異質(zhì)產(chǎn)生機(jī)制的探究，揭示了金黃色葡萄球菌耐藥相關(guān)基因與菌群表型異質(zhì)性對(duì)細(xì)菌群體抗生素耐藥性和環(huán)境適應(yīng)能力的影響。

主要研究結(jié)果如下:

(1)奶牛乳腺炎源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)耐藥相關(guān)基因的檢測(cè)與分析。以奶牛乳腺炎來(lái)源的MRSA菌株BA01611為研究對(duì)象，參考實(shí)驗(yàn)室前期的BA01611在苯唑西林抗生素處理下的RNA-seq數(shù)據(jù)，選擇了15個(gè)表達(dá)水平受抗生素影響且在金黃色葡萄球菌中缺乏研究的基因，構(gòu)建基因敲除質(zhì)粒，最后成功獲得了9株BA01611基因敲除菌株。通過(guò)對(duì)這9株菌以及實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建完成的7株BA01611基因敲除菌株進(jìn)行抗生素耐藥性檢測(cè)，最終發(fā)現(xiàn)了13個(gè)與奶牛乳腺炎源MRSA抗生素耐藥性相關(guān)的基因，包括1個(gè)與抗生素抗性成負(fù)相關(guān)的基因和12個(gè)呈正相關(guān)的基因，其中有3個(gè)基因的敲除嚴(yán)重降低了BA01611菌株的抗生素耐藥性，它們分別為:屬于Lyt R-Cps A-Psr家族的編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因lcpA、屬于Lys R家族的編碼谷氨酸鹽合酶轉(zhuǎn)錄激活因子的基因glt C和屬于Mar R家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SAV0686。

(2)磷酸轉(zhuǎn)移酶基因lcpA對(duì)不同金黃色葡萄球菌抗生素耐藥性和細(xì)胞黏附等生物學(xué)特性影響的研究，以及表型異質(zhì)菌株Mu50△lcpA-LC的分離。本試驗(yàn)構(gòu)建了金黃色葡萄球菌菌株Mu50和Newman的lcpA敲除菌株，并從Mu50的lcpA敲除菌株中分離出一種新的耐藥性增強(qiáng)且能形成大菌落的表型異質(zhì)菌株Mu50△lcpA-LC。通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌抗生素耐藥性發(fā)現(xiàn)lcpA對(duì)抗生素耐藥性的影響存在菌株特異性:敲除lcpA顯著降低了BA01611和Newman對(duì)大部分靶向細(xì)胞壁和核糖體抗生素的抗性;敲除lcpA不影響Mu50對(duì)多數(shù)靶向細(xì)胞壁抗生素的抗性，但降低了其對(duì)靶向核糖體抗生素的耐藥性;敲除lcpA增強(qiáng)了表型異質(zhì)菌株Mu50△lcpA-LC對(duì)靶向細(xì)胞壁抗生素的耐藥性，但不影響其對(duì)靶向核糖體抗生素的耐藥性。此外，通過(guò)各項(xiàng)檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)lcpA對(duì)金黃色葡萄球菌其它生物學(xué)特性也具有菌株特異性的影響:對(duì)于BA01611，敲除lcpA降低了黏附宿主細(xì)胞和菌體抗裂解能力，但增強(qiáng)了生物膜的形成和誘導(dǎo)宿主細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的能力，而對(duì)其菌黃素合成和菌落擴(kuò)散沒(méi)有顯著影響;對(duì)于Mu50，敲除lcpA對(duì)其黏附宿主細(xì)胞、菌體抗裂解、菌落擴(kuò)散和生物膜形成影響不顯著，但能降低其菌黃素的合成，增強(qiáng)其誘導(dǎo)宿主細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的能力。以上結(jié)果表明:lcpA對(duì)金黃色葡萄球菌耐藥性具有重要作用，但對(duì)Mu50具有菌株特異性影響，lcpA對(duì)細(xì)菌致病性的影響比較復(fù)雜;Mu50△lcpA菌株可以通過(guò)在細(xì)菌群體內(nèi)產(chǎn)生表型異質(zhì)亞群Mu50△lcpA-LC來(lái)增強(qiáng)群體對(duì)抗生素的抵抗能力。

(3)金黃色葡萄球菌表型異質(zhì)菌株Mu50△lcpA-LC的表型檢測(cè)及其表型異質(zhì)產(chǎn)生機(jī)制的探究。利用TEM等方法對(duì)Mu50△lcpA-LC表型進(jìn)行全面分析，結(jié)果顯示:Mu50△lcpA-LC的菌黃素合成水平降低、細(xì)胞體積增大，菌落擴(kuò)散能力增強(qiáng)，生物膜形成能力減弱，在平板上形成表型可逆的淡黃色大菌落。通過(guò)與宿主細(xì)胞共孵育發(fā)現(xiàn)Mu50△lcpA-LC具有更強(qiáng)的宿主細(xì)胞黏附能力和刺激宿主細(xì)胞免疫因子表達(dá)的能力。利用q RT-PCR和全基因組測(cè)序等技術(shù)對(duì)細(xì)菌碳源代謝水平進(jìn)行檢測(cè)和基因組序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)Mu50△lcpA-LC通過(guò)上調(diào)acs A等基因的表達(dá)水平加速細(xì)菌在對(duì)數(shù)期對(duì)乙酸鹽的代謝利用，從而下調(diào)cid等基因的表達(dá)，抑制對(duì)數(shù)期菌體細(xì)胞壁的水解和平臺(tái)期細(xì)胞的裂解，同時(shí)，Mu50△lcpA-LC三羧酸循環(huán)顯著增強(qiáng)，細(xì)菌蛋白表達(dá)和分泌模式發(fā)生顯著改變，此外，Mu50△lcpA-LC的編碼蛋白A的基因spa表達(dá)被激活，這可能幫助細(xì)菌逃避機(jī)體免疫。Mu50△lcpA-LC碳源代謝水平的變化可能與其表型異質(zhì)有關(guān)。Mu50△lcpA-LC表型異質(zhì)的發(fā)生可能與其碳源代謝水平發(fā)生變化有關(guān)。

以上結(jié)果表明:Mu50△lcpA可以不依賴(lài)基因序列的變化和環(huán)境改變，在群體內(nèi)部通過(guò)調(diào)控碳源代謝產(chǎn)生具有耐藥和高擴(kuò)散能力等表型優(yōu)勢(shì)的表型異質(zhì)亞群Mu50△lcpA-LC，從而增強(qiáng)細(xì)菌群體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。綜上所述，本試驗(yàn)在奶牛乳腺炎源金黃色葡萄球菌中篩選出了13個(gè)的耐藥相關(guān)基因，全面分析了磷酸轉(zhuǎn)移酶基因lcpA在不同流行菌株中的功能差異，揭示了lcpA功能的菌株特異性。同時(shí)，本試驗(yàn)在Mu50△lcpA菌株群體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新的耐藥表型異質(zhì)亞群Mu50△lcpA-LC，通過(guò)對(duì)表型異質(zhì)亞群的菌群擴(kuò)散能力、抗生素耐藥性和細(xì)胞黏附等表型變化的詳細(xì)闡述，以及對(duì)其表型異質(zhì)產(chǎn)生機(jī)制的探究，揭示了菌群內(nèi)表型異質(zhì)性對(duì)金黃色葡萄球菌應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力的重要作用。本研究豐富了我們對(duì)金黃色葡萄球菌環(huán)境適應(yīng)能力的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)MRSA耐藥性研究提供了材料資源和理論基礎(chǔ)，為治療由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎提供理論依據(jù)。