大鯢(Andrias davidianus)屬兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，為國家二級保護動物，是兩棲綱動物的最大物種，也是動物進化的“活化石”。大鯢屬肉食性動物，食性主要為蛋白類食物。大鯢的生長發(fā)育及攝食種類受季節(jié)性影響較大，大鯢是兩棲綱與爬行綱的過渡類群，其消化道結構復雜，腸道微生物組成多樣。研究大鯢腸道微生物多樣性及產酶活性不僅可以給野生大鯢保護提供依據(jù)，也可以為大鯢人工化養(yǎng)殖預防病害提供依據(jù)。

本論文研究以野生大鯢與養(yǎng)殖大鯢兩種樣品為實驗材料，通過微生物純培養(yǎng)技術與免培養(yǎng)技術全面的分析兩類生境下的大鯢腸道微生物的組成與群落多樣性分析；通過微生物胞外酶研究方法對兩種樣品進行腸道細菌產胞外酶篩選。野生大鯢腸道微生物多樣性及產酶活性分析采用純培養(yǎng)技術分離野生大鯢腸道細菌，選用引物27F/1492R擴增后進行分子生物學鑒定。

結果表明，野生大鯢分離到的86株腸道細菌可劃分為2個門6個屬，變形菌門(Proteobacteria，80.23%)：羅維登斯菌屬，愛德華氏菌屬，檸檬酸桿菌屬；厚壁菌門(Firmicutes，19.77%)：漫游球菌屬，芽孢桿菌屬，賴氨酸芽孢菌屬。應用胞外酶培養(yǎng)基篩選野生大鯢腸道微生物胞外酶活性。結果表明，野生大鯢分離到的86株腸道細菌，產蛋白酶(Proteinase)、淀粉酶(Amylase)、纖維素酶(Cellulase)及脂肪酶(Lipase)菌株依次占總數(shù)的96.51%，73.26%，94.19%，5.82%。

采用免培養(yǎng)技術提取野生大鯢腸道內容物總DNA，選用引物799F/1492R進行特性擴增后連接至載體并轉化，選用質粒引物M13+/M13-篩選，使用限制性核酸內切酶Hae III進行(PCR-RFLP)分析后進行測序，并鑒定到屬。結果表明，野生大鯢腸道細菌的101個克隆單元可劃分為3個門16個屬，變形菌門(Proteobacteria，94.06%)：氣單胞菌屬，不動桿菌屬，慢生根瘤菌屬，鞘脂單胞菌屬，德沃斯氏菌屬，假單胞菌屬，勒克菌屬，拉烏爾菌屬，泛菌屬，黃色單胞菌屬，腸桿菌屬；厚壁菌門(Firmicutes，3.96%)：梭菌屬，枝芽孢桿菌屬，芽孢菌屬。衣原體門(Chlamydiae，1.98%)：嗜衣體屬。

采用免培養(yǎng)技術提取大鯢腸道總DNA，選用古菌特異性109F/958R和Met86F/Met1340R引物擴增后連接至載體pMD-19T并轉化，選用質粒引物M13+/M13-篩選，使用限制性核酸內切酶Afa I進行(PCR-RFLP)分析后進行測序，并鑒定。結果表明，野生大鯢腸道古菌的49個克隆單元可劃分為1個門2個綱，廣古菌門(Euryarchaeota)：熱源體綱(Thermoplasmata，12.24%)，甲烷菌綱(Methanoplasmatales，4.08%)，未分類到綱古菌(Uncultured Archaeon，73.48%)。養(yǎng)殖大鯢腸道微生物多樣性及產酶活性分析采用純培養(yǎng)技術分離養(yǎng)殖大鯢腸道細菌，選用引物799F/1492R擴增后進行分子生物學鑒定到屬。

結果表明，養(yǎng)殖大鯢分離到的97株腸道細菌可分為3個門16個屬，變形菌門(Proteobacteria，87.63%)：愛德華氏菌屬，志賀氏菌屬，沙雷氏菌屬，埃希氏菌屬，沙門氏菌屬，肥桿菌屬，鄰單胞菌屬，耶爾辛氏菌屬，腸桿菌屬，孤菌屬，克呂沃氏菌屬，克雷伯氏菌屬，氣單胞菌屬，假單胞菌；厚壁菌門(Firmicutes，7.22%)：芽孢桿菌屬；放線菌門(Actinobacteria，5.15%)：短桿菌屬。應用胞外酶篩選培養(yǎng)基篩選腸道微生物胞外酶活性。結果表明，養(yǎng)殖大鯢分離到的97株腸道細菌產蛋白酶(Proteinase)、淀粉酶(Amylase)、纖維素酶(Cellulase)菌株占總數(shù)的89.69%，73.20%，86.60%。采用免培養(yǎng)技術提取養(yǎng)殖大鯢腸道內容物總DNA，選用引物799F/1492R進行特性擴增后連接至載體并轉化，選用質粒引物M13+/M13-篩選并(PCR-RFLP)分析后進行測序，鑒定到屬。

結果表明，養(yǎng)殖大鯢腸道細菌的105個克隆單元可劃分為4個門15個屬，變形菌門(Proteobacteria，71.42%)：埃希氏菌屬，志賀氏菌屬，沙雷氏菌屬，耶爾辛氏菌屬，食堿菌屬，沙門氏菌屬，哈夫尼菌屬，希萬氏菌屬，布丘氏菌屬；厚壁菌門(Firmicutes，7.62%)：芽孢桿菌屬，葡萄球菌屬；放線菌門(Actinobacteria，20.01%)：短桿菌屬，戈登氏桿菌屬，紅蝽桿菌屬；擬桿菌門(Bacteroidetes，0.95%)：理研菌屬。