3.結(jié)果

3.1.添加SPC后，微環(huán)境發(fā)生了變化

為了研究添加SPC對微環(huán)境的瞬時影響，在添加SPC劑量后3小時，測試環(huán)境變量，包括pH、ORP和溶解物質(zhì)。圖1a顯示硫酸鹽、碳酸鹽、DOC和pH的量隨著SPC劑量的增加而增加，且增量與SPC劑量呈線性相關(guān)。相反，ORP降低，ORP降低與SPC劑量呈線性相關(guān)。

圖1。加入SPC后，環(huán)境變量發(fā)生變化。（a）SPC劑量與環(huán)境變量增減的關(guān)系；（beh）隨著SPC劑量的不同，環(huán)境變量在不同時期發(fā)生變化（基于鄧肯檢驗，采用SPSS中的雙向方差分析對顯著差異進行檢驗；大寫字母表示不同時期一種治療的差異，小寫字母表示同一時期不同治療之間的差異，n?3，a?0.05）。

基于這些結(jié)果，對于以下結(jié)果，使用對照（C）、低（L）、中（M）和高（H）微宇宙來表示空白對照和三劑量SPC（11.2，22.4，和33.6毫摩爾SPC G-1濕沉積物）。圖1b-h顯示加入SPC后微觀環(huán)境變量的趨勢不同。首先，pH值在第15天下降，之后保持穩(wěn)定。第二，ORP在第15天下降，之后緩慢上升。第三，碳酸鹽和DOC在第15天增加，但在第37天顯著減少，之后保持穩(wěn)定。此外，在使用SPC處理的所有微觀世界中，磷酸鹽在第15天顯著增加，而在L水平處理中減少，在第37天M和H微觀世界中增加。然而，添加SPC后的硫酸鹽在第15天降至C微觀結(jié)構(gòu)的水平，在第50天降至C微觀結(jié)構(gòu)的值以下；在第15天，L、M和H微觀結(jié)構(gòu)中的銨含量超過了C微觀結(jié)構(gòu)中的銨含量。

3.2.添加SPC后微生物群落的潛在代謝活性

圖2a顯示了Biolog生態(tài)板的AWCD，用于描述本地微生物群落的潛在代謝活動。在第0天和第15天，四種處理的AWCD曲線顯示出相似的模式，L、M和H微觀世界的值超過了C微觀世界的值。在第37天和第50天，AWCD曲線的模式發(fā)生變化，在M和H微觀世界中呈現(xiàn)“S”形。

圖2。在不同時期（n?3），對照和SPC處理中所有六組碳源（b）的AWCD曲線（a）和潛在活性（b）。

此外，ECO板的31個碳源分為六組（Pan等人，2015），包括兩種胺/酰胺、六種氨基酸、七種碳水化合物、九種羧酸、四種聚合物和三種其他碳源。圖2b顯示了ECO板在84 h時所有六種類別的平均吸光度。顯然，在羧酸和聚合物基團中，SPC處理和C基團之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異；然而，其他四組在不同時期存在差異。在碳水化合物組中，M和H微觀結(jié)構(gòu)的平均吸光度顯著增加。此外，雜類組在第0天和第15天在M微觀世界中顯著增加，在第15天在H微觀世界中顯著增加。氨基酸組僅在第37天M微觀世界中顯著增加。相反，在胺/酰胺組中，H微觀世界的平均吸光度在第37天顯著降低，M微觀世界在第50天顯著降低。

3.3.添加SPC后本地微生物群落的分類組成和功能群

根據(jù)ANOSIM、ADONIS和MRPP分析（表S2），在每個時期觀察到所有樣本的顯著差異（R>0、R2>0、d>0，均p<0.01）。表1總結(jié)了C和SPC處理的微生物群落的α多樣性。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表明C、L和M微觀世界之間沒有顯著差異，而H微觀世界中的差異顯著。在第15、37和50天，H微觀世界中的潮-1和均勻度顯著降低；然而，在L微觀世界中，這些指數(shù)僅在第15天顯著降低。此外，NMDS結(jié)果顯示H水平處理與其他處理之間存在明顯的距離（圖3A）。

表1不同時期對照和SPC處理微生物群落的α多樣性分析。

圖3B、C和D顯示了門、類和屬級別的微生物群落的分類組成。在門級別（圖3B），微生物群落結(jié)構(gòu)主要由九門組成。在H微觀世界中，擬桿菌和厚壁菌明顯促進并代表優(yōu)勢門，同時抑制鈣地霉、氯曲菌、酸性細菌和變形菌。在M微觀世界中，鈣質(zhì)細菌和酸性細菌受到抑制。除了在第15天，L和C微觀世界中的氯屈曲增加和變形菌和鈣地霉減少外，L和C微觀世界顯示出相似的分布。圖3C顯示了相對豐度超過1%的類別。結(jié)果表明，在任何時候接受SPC處理的微觀世界中，鈣中毒都有所減少。在H微觀世界中，嗜酸桿菌、Holophagae、Caldiserica和Deltaproteobacteria急劇減少，而梭狀芽孢桿菌顯著增加。在M微觀世界中，α變形菌在第37天和第50天急劇增加，同時鈣質(zhì)減少。

圖3。微生物群落結(jié)構(gòu)分析。（A）?；贐ray-Curtis距離的NMDS排序圖；（B）門的分布（相對豐度）≥1%);（C）類別分布（相對豐度）≥1%);（D）屬水平的熱圖和聚類分析（顯示為類/屬水平）（相對豐度）≥0.1%，對數(shù)10標度）；（E）微生物群落功能群的相對豐度（任何示例的相對豐度>1.5%）。

在屬水平上，獲得了37個屬（相對豐度）≥1.0%）和雙聚類分析的熱圖（hclust）用于描述其差異（圖3D）。聚類結(jié)果表明，M微觀世界中的屬與H微觀世界中的屬更相似，而與L和C微觀世界中的屬更相似。此外，37個屬可分為三類：HA（高豐度，從B7到B16）、MA（中等豐度，從B17到B37）和LA（低豐度，從B1到B6）。在HA組中，10屬代表了C微觀世界中的優(yōu)勢類群，其中大部分屬于Deltapoteobacteria類，僅在H微觀世界中減少。其他處理效果不明顯。在馬，屬屬于各種類型的類。在第15、37和50天，WCHB1-69家族中的B17硫曲菌屬和B18屬在M和H微觀世界中均明顯減少，而在第15、37和50天，Coriobacteriae家族中的B19苯桿菌屬、B20溶桿菌屬和B21屬增加。從B26到B30的細菌在H微觀世界中明顯減少。在第15天、第37天和第50天，H和M微觀世界中的LA屬增加，尤其是B5 Petrimonas和B6 Proteininclasticum。在第37天和第50天，M微觀世界中的B4短枝單胞菌明顯增加。

圖3E顯示了自然微生物群落的前八個功能組（相對豐度>1.5%，詳細數(shù)據(jù)和其他組如表S4所示）對時間和SPC劑量的響應(yīng)。在H微觀世界中，能夠進行化學異養(yǎng)、發(fā)酵、需氧化學異養(yǎng)、尿素分解和殼聚糖分解的微生物在整個取樣時間內(nèi)增加。能夠進行硫酸鹽呼吸和硫化合物呼吸的微生物在第0天增加，之后開始減少。能夠暗氧化含硫化合物的微生物在第0天減少，在第15、37和50天增加。除了能夠呼吸硫化物的微生物外，在M微觀世界中，硫酸鹽呼吸和硫化物的暗氧化在第50天減少。其他六組隨時間增加。在L微觀世界中，八組的順序保持不變，盡管它們在第50天減少。

3.4.添加SPC后微生物群落的環(huán)境變量、所考慮的屬和功能組之間的關(guān)系

圖4A顯示了八個功能群與37個屬之間的顯著spearman相關(guān)性（p<0.05）。一方面，能夠發(fā)酵和化學異養(yǎng)的微生物與Petrimonas屬、嗜蛋白菌屬、苛孢霉屬、破蛋白菌屬和未培養(yǎng)的細菌呈梭狀芽孢桿菌的順序呈強正相關(guān)（系數(shù)>0.6）。能夠解脲的微生物與蛋白碎屑菌和梭菌的順序呈強正相關(guān)。此外，能夠進行幾丁質(zhì)分解的微生物與苯桿菌、溶桿菌和短桿菌密切正相關(guān)。此外，能夠進行硫酸鹽呼吸和硫化合物呼吸的微生物與聯(lián)營養(yǎng)菌、聯(lián)營養(yǎng)菌、聯(lián)營養(yǎng)菌和聯(lián)營養(yǎng)菌科細菌密切正相關(guān)。另一方面，能夠發(fā)酵和化學異養(yǎng)的微生物與Smithella、Caldisericum以及不同類別（B28和B30）和不同家族（B29、B32和B18）的細菌具有強烈的負相關(guān)。能夠解脲的微生物與史密氏菌和OPB35類細菌呈強烈的負相關(guān)。

圖4。添加SPC后，環(huán)境變量、所考慮的屬和官能團之間的相關(guān)性分析。（A）功能群與所考慮屬之間的Spearman相關(guān)分析；（B）顯示了環(huán)境變量和考慮的功能組之間的spearman相關(guān)分析（顯著相關(guān)（p<0.05），藍色和紅色圓圈分別表示正相關(guān)和負相關(guān)，行和列用hclust聚集；*表示系數(shù)大于0.6或小于0.6）；（C）基于環(huán)境變量和37個屬的RDA分析。（有關(guān)此圖例中顏色參考的解釋，請讀者參考本文的Web版本。）

圖4B顯示了環(huán)境變量和功能組之間的顯著spearman相關(guān)性；表明大多數(shù)環(huán)境變量與功能組呈正相關(guān)。簡單地說，硫酸鹽主要與硫酸鹽呼吸和硫化物呼吸密切正相關(guān)。DOC、碳酸鹽和磷酸鹽與發(fā)酵、化學異養(yǎng)、尿素分解和需氧化學異養(yǎng)密切正相關(guān)。

RDA圖顯示，37個屬和環(huán)境變量可分為四個部分，由矩形軸分隔（圖4C）。在第一象限中，磷酸鹽、DOC和碳酸鹽主要與B9、B6和B3有關(guān)。在第二象限，硫酸鹽主要與B14和B26屬有關(guān)。在第三象限中，B17、B18、B16和B7主要與ORP相關(guān)，與pH呈負相關(guān)。在第四象限中，銨主要與B2、B19和B4屬相關(guān)。AVS主要與B20相關(guān)。

4.討論

一般來說，各種化合物，如氨、硝酸鹽、硫酸鹽、有機污染物和金屬離子，共存于受污染的沉積物中。其中一些可以用作天然微生物的電子受體或供體。在本研究中，環(huán)境條件與SPC劑量之間的線性關(guān)系（圖1a和表S1）表明，SPC添加量越高，導致溶解物質(zhì)增加，并降低受污染沉積物中的ORP。此外，水生生態(tài)系統(tǒng)中的溶解有機物含有氧化還原活性部分；ORP的下降表明溶解有機物的這些氧化還原部分被氧化，因為氧化部分具有還原電位Eh（Lau等人，2017）。這可能是部分氧化效應(yīng)（De la Calle et al.，2012）和SPC的洗滌效應(yīng)共同作用的結(jié)果。SPC通常被用作H2O2的來源，H2O2是一種強氧化劑，也是洗滌劑的主要成分（Zonfrilli et al.，2009）。此外，環(huán)境條件的后續(xù)變化，包括硫酸鹽還原率升高（圖1b-h）、AVS回收量（圖S1）、溶解有機物還原（圖S2）、有機酸生產(chǎn)（表S3）和ORP升高，這表明產(chǎn)生的氧化有機物和硫酸鹽被本地微生物群落利用。此外，AWCD結(jié)果（圖2）表明，微生物群落的不同代謝活性已增強。此外，在不同時期，代謝活動增強（雜項和碳水化合物，圖2B）和功能微生物份額增加（硫酸鹽呼吸和發(fā)酵，圖3E），表明激活的微生物呼吸僅在實驗開始時保持，并且在整個實驗過程中發(fā)酵得到增強?？傊?，這些結(jié)果表明，添加SPC可間接提供電子受體或供體，以改善污染沉積物中微生物的代謝活性。這是一個有利于降低生態(tài)工程成本的策略，特別是對于原位生物修復。

近年來，由于非培養(yǎng)方法的快速發(fā)展，微生物群落結(jié)構(gòu)的研究受到了前所未有的重視。微生物群落在分類組成上表現(xiàn)出強烈的差異，而其代謝功能和性能可能保持不變（Louca和Doebeli，2017）。因此，徹底調(diào)查微生物群落對添加SPC的反應(yīng)需要對分類組成和功能分析進行共同解釋。獲得的阿爾法多樣性結(jié)果（表1）表明，在SPC的H劑量下，微生物群落的異質(zhì)性可能會下降。獲得的分類學水平結(jié)果表明，在SPC的H劑量下顯著增加的微生物主要屬于厚壁菌門（其中許多產(chǎn)生內(nèi)孢子（Onyenwake et al.，2004）），專性厭氧類梭狀芽孢桿菌（川崎等，1998年）、發(fā)酵類Petrimonas屬（Grabowski等，2005年）和蛋白水解類Proteinicreticum屬（Zhang等，2010年）。此外，在M劑量SPC下增加的微生物主要屬于α蛋白細菌類（在有機富集沉積物中對有機物的分解和同化具有重要作用的細菌（Kunihiro等人，2011））和異養(yǎng)菌屬Brevundimonas（Tsubouchi等人，2014）。相比之下，嗜酸性細菌門、Caldisericia類（硫代硫酸鹽還原菌（Mori et al.，2009））、Holophagae（其成員能夠厭氧降解芳香化合物（Anderson et al.，2012））、硫氧化菌屬Sulfuricurvum（Haaijer et al.，2008；Kodama和Watanabe，2004），鞘氨醇桿菌科的一個屬（Schmidt et al.，2012）是SPC M和H劑量下最脆弱的微生物。受影響的微生物群落在更高的分類水平（如類群或門水平）表現(xiàn)出與屬水平相似的重疊和分類豐度，這表明SPC的加入可能會影響特定狹窄分支內(nèi)的特定屬。此外，在整個實驗期間，所有這些效應(yīng)很難自發(fā)恢復到原始狀態(tài)。關(guān)于功能性基團，獲得的結(jié)果（圖3E和表S4）表明，在所有試驗期間，在M和H劑量的SPC下，最豐富的基團沒有改變，對發(fā)酵、化學異養(yǎng)、尿解和需氧化學異養(yǎng)的影響都是積極的。然而，在試驗后期，H劑量對硫酸鹽呼吸和硫化物呼吸的影響為負。這些發(fā)現(xiàn)表明，微生物群落的分類組成和功能組對添加SPC的反應(yīng)均表現(xiàn)出劑量依賴性偏差。這表明在生態(tài)工程中應(yīng)考慮SPC的劑量。

先前的研究報告了地球化學成分變化與群落結(jié)構(gòu)變化之間的顯著相關(guān)性（Jorgensen等人，2012年；Louca等人，2017年）。在本研究中，改變的環(huán)境變量、顯著增加的微生物組和功能性微生物的優(yōu)勢之間的強相關(guān)性（圖4）表明，添加SPC后，DOC、碳酸鹽和磷酸鹽是主要變量，富集了特定的微生物，脆弱的微生物組群歸因于ORP。然而，除了顯著增加的微生物與上述功能微生物之間的相關(guān)性外，之前的研究報告稱，Petrimonas是產(chǎn)氫細菌（Sun等人，2015），脫氮系統(tǒng)中的蛋白碎屑菌通常非常豐富（Wang等人，2015；Yang等人，2015），柴油中發(fā)現(xiàn)了Brevundimonas（Wang等人，2016）。此外，雜項組的代謝活動增強（圖2b）。很可能，增加的屬可能具有不同的代謝能力，并可能參與沉積物修復中污染物的后續(xù)生物修復。

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