2.材料和方法

2.1.實(shí)驗(yàn)程序

沉積物取樣于中國(guó)珠江三角洲容桂鎮(zhèn)（22°450 N，113°150 E）的一條受工業(yè)和生活廢水污染的城市小溪。這條小溪氧氣有限，有一股特有的臭味。使用前，使用0.149-mm的篩子對(duì)沉積物進(jìn)行篩分、均質(zhì)，并在25°C的暗處儲(chǔ)存。批量試驗(yàn)采用以下程序：首先，在40ml棕色小瓶中構(gòu)建90個(gè)微觀世界，其中含有25g原始沉積物（含水量~60%，氧化還原電位（ORP）~-200mV）和5ml消毒水。其次，將純水（作為對(duì)照）和五劑SPC溶液（Alfa Aesar，中國(guó)）注入微宇宙，使微宇宙中的SPC含量增加到5.6、11.2、16.8、22.4和33.6 mmol SPC g-1濕沉積物。最后，用聚四氟乙烯蓋密封小瓶，立即搖動(dòng)以實(shí)現(xiàn)均質(zhì)，并在25°C的黑暗中靜態(tài)儲(chǔ)存。所有治療均一式三份進(jìn)行。在添加SPC后3小時(shí)（稱為第0天）、15天、37天和50天，對(duì)五個(gè)處理組和對(duì)照組的每18個(gè)樣本進(jìn)行分析。

在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，搖動(dòng)18個(gè)微觀世界以實(shí)現(xiàn)均勻化。首先，用微電極測(cè)定pH和ORP（丹麥Unisense）。然后，提取三份0.5 g沉積物并儲(chǔ)存在?80°C下：一份用于測(cè)試第2.2節(jié)所述的本地微生物群落的潛在代謝活性；第二部分用于提取16S rRNA基因，以進(jìn)行第2.3節(jié)所述的高通量測(cè)序；第三份用于測(cè)定酸揮發(fā)性硫化物（AVS，數(shù)據(jù)如圖S1所示）。以3000 rpm離心殘余沉積物15分鐘，并通過0.45-mm膜過濾上清液以獲得沉積物的液相。這用于測(cè)定溶解物質(zhì)，包括硫酸鹽、硝酸鹽、銨、磷酸鹽、無機(jī)碳（碳酸鹽）和溶解有機(jī)碳（DOC）。使用離子色譜儀（Thermo-DIONEX，ICS-11OO（KOH用作流動(dòng)相）和ICS-900）測(cè)試無機(jī)鹽，使用TOC分析儀（Elementar Vario TOC，德國(guó)）測(cè)試DOC。

2.2.本地微生物群落潛在代謝活性的測(cè)定

如前所述，本地微生物群落的潛在代謝活性由Biolog生態(tài)板（Biolog，美國(guó)）確定（Gu等人，2014年）。簡(jiǎn)言之，將0.5 g濕沉積物和4.5 mL 0.9%NaCl（pH?7.0）超聲處理八次（每次15秒）（KQ-300DE，柯橋），然后沉淀0.5 h以從沉積物中釋放細(xì)菌。之后，提取1 mL懸浮液并添加到新的離心管中，用0.9%的鹽水替換液體兩次，以去除溶解物質(zhì)。在600 nm處，將替換懸浮液的吸光度稀釋至0.05±0.01，以確保每個(gè)樣品包含大致相同的生物量濃度。最后，向ECO板的每個(gè)孔中加入150 mL稀釋溶液。ECO板在30°C的黑暗中孵育。在最初12小時(shí)后，然后每24小時(shí)（直到148小時(shí)）使用微孔板讀取器（Multiskan GO，Thermo）測(cè)量595 nm處的吸光度，以獲得ECO板所有31個(gè)碳源的平均井色顯影（AWCD）。

2.3.DNA提取、16S rRNA基因測(cè)序和分析

根據(jù)先前的研究進(jìn)行了DNA提取和純化（Fang等人，2015）。使用條形碼引物314F（50eCCT ACG GGN GGC WGC AG-30）和805R（50-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-30）擴(kuò)增16S rRNA基因的V3tV4高變區(qū)（Vasileiadis等人，2012年）。使用Illumina Miseq PE300作為測(cè)序平臺(tái)，配對(duì)末端讀數(shù)與FLASH（v2.2.00）連接在一起（Magoc和Salzberg，2011）。在Mothur（v1.39.5）（Schloss等人，2009年）中進(jìn)行了質(zhì)量控制，包括去除低質(zhì)量讀取、嵌合序列和V3tV4區(qū)域的堿基。

隨后的分析在Louca（Louca et al.，2017）描述的QIIME（v1.9.0）（Caporaso et al.，2010）中進(jìn)行，并進(jìn)行了修改：根據(jù)97%的相似性閾值（Edgar，2010），對(duì)照SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)（版本123），將高質(zhì)量序列聚類到操作分類單元（OTU）。這包括usearch的內(nèi)置嵌合體檢查。分類信息通過Uclust方法分配給每個(gè)OTU。在這些初步分析之后，獲得了由1339個(gè)OTU組成的OTU表，其中每個(gè)樣本的讀數(shù)介于12777和42044之間。OTU表被細(xì)化為每個(gè)樣本12777次讀數(shù)，以便后續(xù)分析。

2.4.數(shù)據(jù)分析

對(duì)于多重比較，在SPSS（v20.0）中進(jìn)行T檢驗(yàn)（p<0.05*、p<0.01**和p<0.001***）和鄧肯檢驗(yàn)的方差分析（a?0.05）。進(jìn)行了以下統(tǒng)計(jì)分析：（1）非度量多維標(biāo)度（NMDS）、使用距離矩陣的排列多元方差分析（Adonis）、相似性分析（Anosim）和多反應(yīng)排列程序（MRPP）。使用R studio（v3.3.2）確定微生物群落的總體變化；2）在QIIME中分析了微生物群落的α多樣性值；3）采用層次聚類法比較微生物群落的分類組成；4）此外，為了將微生物群落與一個(gè)或多個(gè)感興趣的代謝功能相關(guān)聯(lián)，如Louca等人（2016）所述，使用原核生物分類群的功能注釋（FAPROTAX）算法預(yù)測(cè)功能組；5）在R studio中，通過冗余分析（RDA）分析環(huán)境變量和微生物組成（被認(rèn)為是屬）之間的關(guān)系；6）spearman秩相關(guān)分析在R studio中進(jìn)行，以調(diào)查（a）功能組和環(huán)境變量之間的關(guān)系，以及（b）功能組和所考慮的屬之間的關(guān)系。

環(huán)境變量和微生物群落對(duì)污染沉積物中添加過碳酸鈉的響應(yīng)——摘要、介紹

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