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結(jié)果和討論
同時進行偶氮還原和電流生成。 在MFC或NA反應(yīng)器中，莧菜紅在28小時內(nèi)完全還原（圖1A），但含有10 mM莧菜紅的MFC除外，其中0.7 mM莧菜紅因電子供體耗盡而殘留。 在非生物反應(yīng)器中未檢測到莧菜紅還原。 MFC中的莧菜紅還原率通常低于含有相同莧菜紅濃度的NA反應(yīng)器中的還原率，這表明電流的產(chǎn)生使一些電子流偏離了偶氮還原。 此外，所有反應(yīng)器中的莧菜紅還原率隨著莧菜紅濃度的增加而增加，盡管我們研究中使用的偶氮染料濃度（高達10 mM）高于其他報告中使用的濃度，31表明該菌株具有較高的偶氮還原能力。
圖1。 同時減少莧菜紅和電流產(chǎn)生。 （A） 在MFC（實線）和NA反應(yīng)器（虛線）中還原不同濃度的莧菜紅。 插圖顯示了MFC和NA反應(yīng)器中莧菜紅的還原速率。 （B） 含有不同濃度莧菜紅的MFC中的當(dāng)前世代。
圖1B顯示了當(dāng)前一代帶有或不帶莧菜紅的MFC（完整的當(dāng)前一代周期如圖S3所示，支持信息）。 莧菜MFC在接種時產(chǎn)生0.01 mA的電流，而帶有莧菜紅的MFC在電流產(chǎn)生之前有大約8 h的滯后期（圖1B），這表明浮游細胞更喜歡莧菜紅作為電子受體而不是陽極。 伴隨著偶氮還原，含有莧菜紅的MFC的電流在滯后階段后迅速增加，幾乎是不含莧菜紅的MFC的2倍（即，含有2、5、7和10 mM莧菜紅的MFC的電流分別為0.3、0.34、0.29和0.28 mA，而不含莧菜紅的MFC的電流為0.13 mA）。 在含有莧菜紅的MFC中產(chǎn)生的增強電流可歸因于莧菜紅還原產(chǎn)生的萘酚的電子介體作用。含有5 mM莧菜紅的9個MFC產(chǎn)生的電流最高， 由于毒性，在較高莧菜紅濃度下觀察到脫色S.細胞的代謝活性降低（圖S4，支持信息）。32因此，在后續(xù)實驗中，5 mM莧菜紅被用作替代電子受體。
浮游生物和生物膜細胞生長。 含有莧菜紅的MFC中基于蛋白質(zhì)的浮游生物量約為無莧菜紅MFC的兩倍，但與具有相同莧菜紅濃度的NA反應(yīng)器中的浮游生物量無顯著差異（圖2A）。 結(jié)果表明，陽極呼吸對浮游細胞的生長沒有顯著影響，即浮游細胞的生長主要由莧菜紅還原而不是電極呼吸驅(qū)動。 這與先前的報告一致，即脫色鏈球菌當(dāng)前的產(chǎn)生是以生物膜為主，陽極呼吸的脫色鏈球菌細胞更傾向于附著在陽極表面，而不是懸浮在培養(yǎng)液中。 33,34 含有莧菜紅的MFC中基于蛋白質(zhì)的浮游生物量約為無莧菜紅MFC的兩倍，但與具有相同莧菜紅濃度的NA反應(yīng)器中的浮游生物量無顯著差異（圖2A）。結(jié)果表明，陽極呼吸對浮游細胞的生長沒有顯著影響，即浮游細胞的生長主要由莧菜紅還原而不是電極呼吸驅(qū)動。這與先前的報告一致，即脫色鏈球菌當(dāng)前的產(chǎn)生是以生物膜為主，陽極呼吸的脫色鏈球菌細胞更傾向于附著在陽極表面，而不是懸浮在培養(yǎng)液中。33,34
圖2。 脫色鏈球菌的生長受不同電子受體的影響。 （A） 蛋白質(zhì)濃度的變化，作為有無莧菜紅（5 mM）或鈉反應(yīng)器的MFC中浮游細胞的指標(biāo)。 （B） 32小時后，帶有或不帶有莧菜紅或鈉反應(yīng)器的MFC陽極上的蛋白質(zhì)含量。
與浮游細胞不同，含有莧菜紅的MFC中陽極生物膜的蛋白質(zhì)含量顯著高于不含莧菜紅的MFC（P<0.01）和NA反應(yīng)器（P<0.05）（圖2B），表明偶氮還原和電流生成都有助于生物膜的生長。 生物膜生物量的差異表明，在含有莧菜紅的MFC中，偶氮還原占生物膜生物量的主要部分，而當(dāng)前一代占較小的部分。 這些生物量差異與基于吉布斯自由能計算的預(yù)期差異一致，這表明莧菜紅還原產(chǎn)生的自由能可能高出3倍以上( 生物膜生物量的差異表明，在含有莧菜紅的MFC中，偶氮還原占生物膜生物量的主要部分，而當(dāng)前一代占較小的部分。這些生物量差異與基于吉布斯自由能計算的預(yù)期差異一致，這表明莧菜紅還原產(chǎn)生的自由能可能高出3倍以上(?61.8 J，用公式S1計算，支持信息）比陽極呼吸產(chǎn)生的值高(?17.7 J，用等式S2計算，支持信息），在含有5 mM莧菜紅的MFC中。
生物膜中的pH和氧化還原電位曲線。 用O2微電極進行的測量證實，在實驗過程中，散裝液體是缺氧的（圖S5，支持信息）。 pH微電極測量（圖3A，B）表明，隨著細胞生長，體積液體pH值降低，即，含有莧菜紅的MFC（6.43）<NA反應(yīng)器（6.55）<無莧菜紅的MFC（6.65），表明謝瓦納菌細胞外呼吸期間分泌酸性代謝物。 由于細菌電極呼吸是一種質(zhì)子釋放反應(yīng)，因此含莧菜紅的MFC中電流產(chǎn)生的更大增加也會降低pH值。 在無莧菜紅的MFC的生物膜中觀察到pH梯度下降（約0.02），這表明質(zhì)子在陽極呼吸生物膜中的積累與之前的預(yù)測一致。35本研究中觀察到的pH梯度小于在其他陽極呼吸生物膜中觀察到的pH梯度（0.08到1個單位）， 17,36這可能是由于較薄的生物膜或Shewanella生物膜相對較高的擴散效率。37與陽極呼吸生物膜相比，分別與陽極和莧菜呼吸或僅與莧菜呼吸時，生物膜中的pH梯度降低或消失。 這是因為質(zhì)子可能被莧菜紅還原生成的萘胺所消耗。
用氧化還原微電極測定了不同生物膜內(nèi)的氧化還原電位。 無細胞反應(yīng)器的結(jié)果表明，莧菜紅對氧化還原電位曲線沒有任何顯著影響（圖S6，支持信息）。 所有接種反應(yīng)器的散裝液體中的氧化還原電位從陽極表面上方約4mm處向陽極急劇下降（圖3C），表明還原當(dāng)量的累積在生物膜之外的可測量距離（幾毫米）處開始。 無論使用何種電子受體，所有生物膜內(nèi)的電位持續(xù)降低約30 mV（圖3C，D）。 Shewanella細胞和電極之間的電子轉(zhuǎn)移基本上是由黃素作為外膜細胞色素c（如MtrC/OmcA）的輔因子介導(dǎo)的，這已在菌株S12.12,24,38催化的MFC中得到證實。 生物膜中的pH變化可能導(dǎo)致1.2或2.4 mV的電位梯度 17莧菜紅呼吸生物膜電極表面電位下降是預(yù)期的，因為電子從生物膜轉(zhuǎn)移并逐漸氧化為散裝液體，如生物膜呼吸中所觀察到的 39,40 Picioreanu及其同事預(yù)測，含有電子介體的陽極呼吸生物膜內(nèi)的氧化還原電位會隨著電子介體的氧化還原狀態(tài)先降低，然后升高。 35該預(yù)測適用于Shewanella生物膜，正如Shewanella陽極呼吸一樣 38陽極呼吸生物膜內(nèi)的電位持續(xù)下降至 17 無細胞反應(yīng)器的結(jié)果表明，莧菜紅對氧化還原電位曲線沒有任何顯著影響（圖S6，支持信息）。所有接種反應(yīng)器的散裝液體中的氧化還原電位從陽極表面上方約4mm處向陽極急劇下降（圖3C），表明還原當(dāng)量的累積在生物膜之外的可測量距離（幾毫米）處開始。無論使用何種電子受體，所有生物膜內(nèi)的電位持續(xù)降低約30 mV（圖3C，D）。Shewanella細胞和電極之間的電子轉(zhuǎn)移基本上是由黃素作為外膜細胞色素c（如MtrC/OmcA）的輔因子介導(dǎo)的，這已在菌株S12.12,24,38催化的MFC中得到證實。生物膜中的pH變化可能導(dǎo)致1.2或2.4 mV的電位梯度（分別針對一個或兩個電子轉(zhuǎn)移過程，使用公式S3計算，支持信息），其遠小于檢測生物膜中的電位梯度（30 mV）這與Shewanella陽極生物膜電位下降與pH無關(guān)的建議一致。17莧菜紅呼吸生物膜電極表面電位下降是預(yù)期的，因為電子從生物膜轉(zhuǎn)移并逐漸氧化為散裝液體，如生物膜呼吸中所觀察到的與氧、硫酸鹽或硝酸鹽混合。39,40 Picioreanu及其同事預(yù)測，含有電子介體的陽極呼吸生物膜內(nèi)的氧化還原電位會隨著電子介體的氧化還原狀態(tài)先降低，然后升高。35該預(yù)測適用于Shewanella生物膜，正如Shewanella陽極呼吸一樣受到電子介質(zhì)，即黃素的抑制。38陽極呼吸生物膜內(nèi)的電位持續(xù)下降至?然后在陽極表面幾微米（<10μm）范圍內(nèi)，340 mV顯著增加至102 mV，這與上述預(yù)測一致，并且與使用極化陽極呼吸的S.oneidensis MR-1生物膜中的電位分布相似。17
圖3.不同反應(yīng)器中陽極上方的pH和氧化還原電位分布。（A）從液體表面到陽極表面的pH分布。（B）陽極表面上方95μm范圍內(nèi)pH分布的放大。（C）從液體表面到陽極表面的氧化還原電位分布。（D） 陽極表面上方95μm范圍內(nèi)的電位分布放大。0μm深度代表生物膜 ? 陽極界面，虛線表示近似的生物膜 ? 液體界面（紅色表示莧菜呼吸生物膜；綠色表示陽極呼吸生物膜；藍色表示生物膜同時呼吸），通過實時顯微鏡監(jiān)測（300×）和CLSM生物膜結(jié)構(gòu)觀察確定界面。
陽極表面電位( ?含有莧菜紅的MFC和不含莧菜紅的MFC（分別為68或102 mV）遠高于相應(yīng)的生物膜電位。此外，可通過改變陰極條件來調(diào)節(jié)陽極表面電位，即斷開外部電路或降低陰極鐵氰化物濃度可顯著降低MFC陽極表面電位，當(dāng)連接鈉反應(yīng)器的陽極和陰極時，可能會導(dǎo)致陽極表面電位急劇增加，并立即產(chǎn)生電流（0.2 mA，圖S7，支持信息）。然而，這種陰極變化并未對所有反應(yīng)器中的生物膜電位產(chǎn)生直接影響，表明生物膜內(nèi)的氧化還原狀態(tài)不受影響。通過生物膜和陽極表面之間的電位間隙進行電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的能量將由細菌細胞而不是電流產(chǎn)生來保存。28因此，適當(dāng)降低陽極表面電位可能會增加陰極?陽極電壓和增加MFC電流的產(chǎn)生。Shewanella陽極呼吸生物膜內(nèi)的電位下降趨勢與地桿菌生物膜相反。基于生物膜電子載體（PilA、細胞色素c或黃素）和擴散效率的差異，在兩種模型外生電子的生物膜內(nèi)可以假設(shè)13種不同的電子轉(zhuǎn)移機制。
圖4。 不同電子受體呼吸的生物膜內(nèi)的活性分布。 A、 B和C分別是在CLSM下觀察到的莧菜紅呼吸生物膜、陽極呼吸生物膜和同時莧菜紅和陽極呼吸生物膜的垂直截面。 D、 E和F分別是基于莧菜紅呼吸生物膜、陽極呼吸生物膜和同時莧菜紅和陽極呼吸生物膜的CLSM結(jié)果的定量活性曲線。 低活性和受損膜的細胞呈紅色，而高活性和完整膜的細胞呈綠色。 0μm處的生物膜層為生物膜 ? 電極界面（底部）。
生物膜內(nèi)的活性分層。 在所有生物膜中均觀察到不均勻分布的塔狀細胞簇結(jié)構(gòu)。 與生物膜蛋白含量的觀察類似，含有莧菜的MFC中的生物膜（48μm）比莧菜MFC（32μm）或NA反應(yīng)器（41μm）中的生物膜厚（圖4）。 活性染色顯示，陽極和莧菜紅共同呼吸的生物膜總活性（0.97）高于僅陽極和莧菜紅呼吸的生物膜（0.94）或莧菜紅（0.66）。 僅用莧菜紅呼吸的生物膜的活性從電極上增加 ? 生物膜與生物膜的界面（底部，0.66） ? 液體界面（頂部，0.96）。 該曲線與呼吸氧氣或其他可溶性電子受體的生物膜中的曲線一致。22,41相反，陽極呼吸生物膜中的活性分層從底部（0.99）下降到頂層（0.81），類似于S.oneidensis MR-1、G.sulfurreducens、， 銅綠假單胞菌和革蘭氏陽性細菌Thermincola potens。 23,42,43可以用生物膜中的電子跳躍電子轉(zhuǎn)移機制來解釋，無法接近陽極表面的細菌細胞不能以足夠的速率將電子轉(zhuǎn)移到陽極， 這將生物膜細胞的細胞代謝活性限制在閾值距離內(nèi)。13,44這也可以解釋為什么Shewanella陽極呼吸生物膜的厚度通常限制在幾十微米以內(nèi)。14相反， Geobacter陽極呼吸生物膜的厚度可以達到數(shù)百微米，并保持均勻的導(dǎo)電性，14盡管其擴散效率低于Shewanella生物膜，37進一步表明Shewanella使用不同的電子轉(zhuǎn)移機制。 陽極呼吸生物膜底部的高活性也排除了莧菜呼吸生物膜中活性降低是由于質(zhì)子積累或缺乏乳酸引起的可能性。 因此，僅使用陽極或莧菜紅呼吸的生物膜內(nèi)的反向活性曲線依賴于電子受體，并且與假定的電子轉(zhuǎn)移曲線一致。 這在同時呼吸陽極和莧菜紅的生物膜中有所不同，這表明在生物膜中具有更高的均勻活性， 表明生物膜內(nèi)的雙向電子轉(zhuǎn)移可以補償陽極或莧菜紅作為唯一電子受體無法接近的生物膜細胞的活力損失。
生物膜的呼吸系統(tǒng)和生理層次中的電子受體的依賴性——摘要、介紹
生物膜的呼吸系統(tǒng)和生理層次中的電子受體的依賴性——材料和方法
