材料和方法

菌株。 脫色鏈球菌菌株S12T（CCTCC M203093T=IAM 15094T）是從紡織印染廢水處理廠的活性污泥中分離出來的，并在我們的實驗室保存。20,21該菌株可以使用莧菜紅（圖S1，支持信息）或鐵（III） 作為電子受體并在MFC的陽極上形成生物膜。9,20,21來自Luria的單一菌落菌株S12 ? 選取Bertani（LB）平板并將其接種到滅菌的LB肉湯中，培養(yǎng)物在30°C下有氧培養(yǎng)過夜。通過離心（6000g）將細(xì)胞與培養(yǎng)物分離2分鐘，然后使用滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌兩次以去除殘余營養(yǎng)物。 洗滌后的細(xì)胞用作MFC的接種物。

MFC和操作。 如前所述組裝雙室MFC。使用9塊普通石墨板（2 cm×3 cm×0.2 cm）作為陽極和陰極。 使用Ag/AgCl電極（+0.197 V vs標(biāo)準(zhǔn)氫電極）作為陽極的參比電極。 陽極室和陰極室用一塊Nafion 115膜（7.1 cm2）隔開。 組裝和滅菌（115°C 20 min）后，向陽極室（120 mL）中填充100 mL LM培養(yǎng)基（12.8 g/L Na2HPO4、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、1.0 g/L NH4Cl和10 mM乳酸，pH 6.8）。 為了刺激生物膜生長，向培養(yǎng)基中添加0.05%（w/v）的酵母抽提物。 除非另有說明，否則將不同濃度的偶氮染料莧菜紅（0、2、5、7和10 mM）作為替代電子受體添加到陽極室中。 陰極電解質(zhì)含有100毫升PBS和50毫米鐵氰化鉀。 在接種（2%，v/v）后，用N2鼓泡陽極室以去除頂空空氣和溶解氧，然后用橡膠塞密封。 MFC在30°C下運行，外部電路閉合，包括1000Ω外部電阻器。 一組相同數(shù)量的斷路MFC與正常厭氧（NA）控制反應(yīng)器并聯(lián)運行。 含有不同濃度莧菜紅的非生物反應(yīng)器也用于評估莧菜紅的效果和可能的電化學(xué)還原。 使用數(shù)據(jù)記錄器（Keithley 2700，模塊7702）監(jiān)測電流生成。 在每種實驗條件下，反應(yīng)器分三次運行。

化學(xué)和生理分析。 如前所述，在520 nm處的吸收用于監(jiān)測莧菜紅濃度的變化。如前所述，20,21蛋白質(zhì)含量被量化，以評估浮游細(xì)胞和生物膜的細(xì)胞生長，因為偶氮染料因其紅色和對細(xì)胞分裂的抑制作用，可干擾光學(xué)分析和菌落計數(shù)。9 共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）用于分析生物膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞活性 ? 24在CLSM分析之前，對陽極上的生物膜進(jìn)行取樣，并將其浸入已滅菌的PBS中，以去除松散附著在生物膜上的浮游細(xì)胞或碎屑。 然后用活/死BacLight染色試劑盒（分子探針，Invitrogen）對樣品進(jìn)行染色，并在CLSM（LSM 700，蔡司）下觀察。 染色試劑盒是基于細(xì)菌膜滲透性開發(fā)的，通常用于區(qū)分高（綠色）或低（紅色）生長活性的細(xì)菌，而不是確定細(xì)胞是活的還是死的。觀察并分析每個陽極生物膜的25個隨機(jī)取樣視野。 為了獲得三維（3D）結(jié)構(gòu)信息，在Zen軟件（蔡司）的“堆?！蹦Ｐ拖掠^察生物膜樣品。 分析每個生物膜層的比活力，并根據(jù)像素計數(shù)將其表示為活細(xì)胞與總生物膜細(xì)胞的比率。9,22生物膜樣品的總活力是每個生物膜層的平均活力。

微電極分析。 在莧菜紅耗盡之前，使用微電極系統(tǒng)（丹麥Unisense）（圖S2，支持信息）測定散裝液體和陽極生物膜內(nèi)的溶解氧、pH值和氧化還原電位分布。26,27在分析之前， 將MFC陽極室的橡膠塞更換為parafilm，通過parafilm插入微電極（尖端直徑25μm），并使用SensorTrace Pro（v.3.2.7）軟件朝陽極表面下壓。 使用顯微鏡（300×超級眼）監(jiān)測微電極尖端的位置。

生物膜的呼吸系統(tǒng)和生理層次中的電子受體的依賴性——摘要、介紹

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