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材料和方法
沉積物和地下水收集
沉積物樣本于 2012 年 12 月和 2013 年 7 月從日本廣島大學(xué) (34°24.060 N, 132°42.790 E) 的 Budo Pond 收集。 采樣點(diǎn)的特點(diǎn)是在地下水排放點(diǎn)附近有大量的橙色沉積物（圖 1A）。 地下水緩慢流過沉積物表面，從管道流向開放的池塘。 外框和池底用混凝土覆蓋，從而確保管道是池中地下水的唯一來源。 沉積物分布在距地下水源約 1.5 m 處。 沉積物的深度為 15-120 厘米，具體取決于其與管道的距離。
圖 1 日本廣島大學(xué)武道池（A）沉積物照片。 地下水從管道供應(yīng)到開放的池塘。 大量的 Fe(III) 沉積物散布在管道附近。 箭頭表示地下水的流動(dòng)方向。 從圖 A 所示的管道（地下水源）30 厘米處收集的 (B) 沉積物芯的照片。在一系列沉積物中，顏色明顯變化。
通過將丙烯酸管（直徑，8 厘米；長(zhǎng)度，15 厘米）直接插入沉積物中來收集兩個(gè)核心。 在距地下水源 30 厘米處收集兩個(gè)沉積物核心。 一個(gè)核心用于 16S rRNA 基因分析、礦物物種形成和孔隙水化學(xué)表征，而另一個(gè)用于微電極和 大麻分析。
從管道供應(yīng)的地下水（圖 1A）與巖心取樣的同一天收集。 使用 0.2 lm 膜（Advantec，東京，日本）過濾地下水，并如下所述進(jìn)行化學(xué)分析。
pH、氧化還原電位和溶解氧的微電極分析
沉積物中的溶解氧 (DO)、pH 值和氧化還原電位 (Eh) 在實(shí)驗(yàn)室中使用微電極并按照 Shiraishi 等人描述的方案進(jìn)行測(cè)量。 (2010)。 DO 和 Eh 電極購(gòu)自 Unisense (Aarhus, Denmark)。 pH 電極按照 Gieseke & de Beer (2004) 的描述制備。 用于微電極分析的沉積物核心在我們的實(shí)驗(yàn)室中在室溫下儲(chǔ)存約 1 小時(shí)，以允許在樣品運(yùn)輸過程中可能被攪動(dòng)的顆粒沉降。 使用電動(dòng)顯微操作器 (Unisense) 以 1 mm 的間隔進(jìn)行從 0 cm（水-沉積物界面）到 4 cm 深度的微電極測(cè)量。 在沉積物深度低于 4 cm 時(shí)，通過將微電極直接水平插入巖心采樣器塑料體上的小孔中，以 2 cm 的間隔進(jìn)行微電極測(cè)量。 DO微電極的檢測(cè)限為0.3 lM。
孔隙水取樣和化學(xué)分析
在缺氧室（Coy Laboratory Products, Grass Lake, MI, USA; Ar:H2 = 98%:2%; [O2] < 0.01 ppm）。 然后通過使用 0.2-lm 膜過濾器 (Advantec) 的真空過濾將所得樣品分離為孔隙水和沉積物相。 收集孔隙水后，根據(jù) Fadrus & Maly (1975) 描述的方案，通過 1,10-菲咯啉方法通過分光光度法測(cè)量溶解的 Fe2+ 濃度。 在缺氧室中，從沉積物中分離出的孔隙水立即與醋酸銨緩沖液中的 1,10-菲咯啉混合。 使用分光光度計(jì)（Thermo Scientific GENESYS 20；Thermo Fisher Scientific Inc.，Osaka，Japan）在 510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量紅色溶液。
剩余的孔隙水用于測(cè)定無(wú)機(jī)和有機(jī)離子濃度。 使用離子色譜儀（Dionex ICS-1100；Thermo Fisher Scientific Inc.）鑒定主要陽(yáng)離子（Na+、K+、Mg2+、Ca2+）和離子（Cl–、硫酸根和NO?3）。 使用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICP-AES SPS3510；SII Nano Technology Inc.，Tokyo，Japan）測(cè)定溶解的 Mn2+ 濃度。 堿度通過 Gran 滴定法用 0.1 M HCl 測(cè)定。 通過 Ijiri 等人描述的方法測(cè)量乙酸鹽濃度。 (2012) 使用同位素比監(jiān)測(cè)液相色譜質(zhì)譜儀，其中包括連接到 Thermo Scientific LC IsoLink 的 Thermo Finnigan DELTAplusXP 同位素比質(zhì)譜儀 (IR-MS)。
鎂濃度和穩(wěn)定同位素分析
沉積物中孔隙水濃度在 0-10 cm 范圍內(nèi)的所有深度進(jìn)行測(cè)量。 此外，在7 cm以下的深度測(cè)量孔隙水的碳和氫穩(wěn)定同位素，以闡明沉積物中形成甲烷的途徑。 將大約 6 g 切片的濕沉積物插入 20 mL 血清瓶中，并向瓶中加入 1 mL 飽和氯化汞以阻止任何微生物活動(dòng)。 然后用丁基塞子卷曲密封瓶子。 在分析之前，將樣品置于熱水浴（約 80°C）中 15 分鐘，以對(duì)沉積物中溶解的蒸發(fā)進(jìn)行脫氣。 對(duì)于地下水測(cè)量，大約 10 mL 未過濾的地下水被收集到 10 mL 丁基塞血清瓶中。 在用丁基塞進(jìn)行卷邊密封之前，將 1 mL 等分的飽和氯化汞加入瓶中。 用同位素比監(jiān)測(cè)氣相色譜質(zhì)譜儀測(cè)定了鎂的濃度和穩(wěn)定同位素組成。 穩(wěn)定同位素組成由下式計(jì)算：
其中 Rsample 和 Rstandard 分別表示樣品和內(nèi)標(biāo)中的 13C/12C 或 D/H 比率。 分別使用 Vienna Pee Dee belemnite 碳酸鹽和 Vienna Standard Mean Ocean Water 作為碳和氫的內(nèi)標(biāo)。 本研究中使用的 IRG 配備了一個(gè)端口，該端口在氧化為 340 °C 的 340 °C 下選擇性捕集蒸發(fā) CMS 以進(jìn)行 d13C 測(cè)量。 對(duì)于 d 測(cè)量，在 1450 °C 下進(jìn)行熱解，并將產(chǎn)生的樣品氣體（或 H2）引入 IR-MS。
HCl 可萃取的 Fe 分析
使用兩種濃度的 HCl（0.5 和 6 M）并行進(jìn)行酸提取，以量化沉積物中的 Fe 含量。 在缺氧室中對(duì)沉積物取樣后，將切片的沉積物用無(wú) O2 的 MilliQ 水（Millipore，Tokyo，Japan）洗滌兩次，以去除沉積物中溶解的 Fe2+。 為避免實(shí)驗(yàn)過程中 Fe(III) 還原或 Fe(II) 氧化，根據(jù) DO 曲線改變了實(shí)驗(yàn)條件。 來自 0-2 厘米深度范圍內(nèi)的沉積物樣品，其中存在好氧到缺氧條件，在室溫下進(jìn)行有氧處理。 2 厘米以下的沉積物樣品，其中存在缺氧條件，在室溫下在缺氧室中進(jìn)行厭氧處理。 樣品干燥后，用 5 mL 0.5 M 或 6 M HCl 處理每個(gè)深度的兩份 10 mg 沉積物 1 小時(shí)。 通過ICP-AES分析溶解的Fe。 溶解在 6 M HCl 中的 Fe 礦物對(duì)應(yīng)于總 Fe 含量 (Poulton & Canfield, 2005)。
大塊和表面敏感的 Fe K 邊緣 EXAFS 分析 大塊 Fe K 邊緣 EXAFS 光譜是在 SPring-8（日本兵庫(kù)）使用光束線 BL01B1 獲得的。 測(cè)量是使用完全調(diào)諧的 Si (111) 雙晶單色儀進(jìn)行的，帶有鍍鎳反射鏡，角度為 6.0 mrad。 光束尺寸調(diào)整為大約 1 9 0.8 mm2。 通過將赤鐵礦的前邊緣峰值最大值設(shè)置為 7111 eV 來校準(zhǔn)能量。 所有樣品，包括標(biāo)準(zhǔn)礦物（水鐵礦、針鐵礦和菱鐵礦）和沉積物樣品，均在快速 EXAFS (Q-EXAFS) 透射模式下進(jìn)行分析，其中 EXAFS 光譜從 6790 到 7680 eV。 濕沉積物樣品安裝在混合纖維素酯膜（Millipore，Billerica，MA，USA）上，然后密封在缺氧室中。 樣品保存于 ? 分析前 80 °C。 Q-EXAFS 光譜分析三次。 我們的結(jié)果證實(shí)在測(cè)量過程中沒有發(fā)生光子氧化或還原。
在 CEY 模式下，通過 Fe K-edge EXAFS 分析表面敏感的 Fe 礦物種類。 使用光子工廠（日本筑波）的光束線 BL12C，使用帶有 Rh 涂層反射鏡的全調(diào)諧 Si（111）雙晶單色器以 7.0 mrad 的角度進(jìn)行測(cè)量。 Itai 等人描述了本研究中使用的 CEY-EXAFS 技術(shù)和設(shè)備的詳細(xì)信息。 (2008)。 CEY-EXAFS 測(cè)量是使用 CEY 檢測(cè)器單元進(jìn)行的。 石墨電極放置在 CEY 檢測(cè)器單元的中心，并用金屬盒覆蓋以保持 He 氣氛。 將與用于 HCl 可萃取 Fe 分析的相同的干燥樣品分散在一塊碳帶上。 然后將該膠帶貼在一塊鋁箔上，然后將其放置在石墨電極上。 在測(cè)量過程中，高壓電源固定在 300 或 400 V。 合成水鐵礦的 CEY-EXAFS 光譜被證實(shí)與在體透射模式下測(cè)量的樣品相同。 使用 ATHENA EXAFS 分析軟件包 (Ravel & Newville, 2005) 分析所有 EXAFS 數(shù)據(jù)。
TEM 觀察沉積物的微觀結(jié)構(gòu)和礦物學(xué)通過 TEM (JEOL JEM-2010, Tokyo, Japan) 進(jìn)行研究。 無(wú)論沉積層的深度如何，樣品制備都是在缺氧室中進(jìn)行的。 將選定層的少量沉淀物轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的 1 mL 微量離心管中。 將乙醇以一系列分級(jí)濃度（30%、50%、70%、80%、90% 和 100%）加入管中。 使用移液管輕輕混合溶液。 每個(gè)乙醇濃度脫水10分鐘，離心后傾析上清液（2000 9g；2分鐘）。 加入100%乙醇后，將一滴懸浮樣品置于銅網(wǎng)上。 網(wǎng)格在缺氧室中干燥過夜。 樣品在從缺氧室中取出之前進(jìn)行密封，以防止樣品運(yùn)輸過程中 Fe(II) 礦物的氧化。 TEM觀察在200kV的加速電壓下進(jìn)行。
使用 16S rRNA 基因克隆文庫(kù)進(jìn)行分析
使用乙醇消毒的刮刀將沉積物樣品切片后，將它們轉(zhuǎn)移到缺氧室中的消毒離心管中并儲(chǔ)存在 ? 分析前 80 °C。 對(duì)代表性層，即 1 和 2 厘米（表層）、4 和 10 厘米深度處的沉積物混合物進(jìn)行 16S rRNA 基因分析，以確定微生物群落隨著沉積物層深度的增加而發(fā)生的變化。 根據(jù)制造商的說明，使用 DNA 分離試劑盒（PowerMax 土壤 DNA 分離試劑盒；MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA）提取 DNA。 使用 530F 和 907R 引物組的通用引物擴(kuò)增 16S rRNA 基因，從而靶向細(xì)菌和古細(xì)菌 16S rRNA 基因（Nunoura 等，2012）。 16S rRNA 基因片段通過聚合鏈反應(yīng) (PCR) 擴(kuò)增（Nunoura 等，2012）。 PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳驗(yàn)證并使用MiniElute凝膠提取試劑盒（Qiagen，Tokyo，Japan）純化。 然后將 PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌菌株 K12 中。 克隆在 37°C 下孵育過夜，隨機(jī)選擇總共 94 個(gè)克隆并測(cè)序（3730XL DNA 測(cè)序儀；Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA）。
具有 > 97% 同一性的 16S rRNA 基因序列被分組到一個(gè)可操作的分類單元中。 使用基于 ARB-SILVA 106 數(shù)據(jù)庫(kù) (www.arb-silva.de) 的 ARB 軟件包 (Ludwig et al., 2004) 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。 細(xì)菌和古細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹是使用 MEGA5 的最大似然法構(gòu)建的（Tamura 等，2011）。
