粉紅色漿果聯(lián)合體的系統(tǒng)發(fā)育多樣性：16S rRNA基因調(diào)查

對(duì)粉紅色漿果聚集體中發(fā)現(xiàn)的16S rRNA基因的分析證明了一個(gè)一致的、簡(jiǎn)單的群落，其中兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)育型（定義為97%序列同一性聚類）占測(cè)序克隆的65%以上（來(lái)自三個(gè)樣本的總共273個(gè)序列，圖2一種）。PB-PSB1是最豐富的系統(tǒng)發(fā)育型（占序列的35-53%），是一種未培養(yǎng)的紫硫細(xì)菌（PSB），屬于的Halochromatium-Thiohalocapsa譜系色科（支持信息，圖S1）。

A.16S rRNA基因序列從粉紅色漿果中分離出來(lái)，這些漿果采集于2011年（89克隆）彭贊斯角沼澤，2010年（94克?。┖?007年（90克?。㎜ittle Sippewissett沼澤。兩個(gè)操作分類單元(OTU)，紫硫細(xì)菌(PB-PSB1)和硫酸鹽還原菌(PB-SRB1)，占觀察到的序列的60%以上。

B.全長(zhǎng)PB-SRB1 OTU和相關(guān)最大似然系統(tǒng)發(fā)育D esulfobulbaceae的。來(lái)自未培養(yǎng)生物的環(huán)境序列以灰色顯示。超過(guò)50%的引導(dǎo)程序支持（500次復(fù)制）顯示在節(jié)點(diǎn)上。分支長(zhǎng)度（和比例尺）對(duì)應(yīng)于各個(gè)分支上每個(gè)位點(diǎn)的平均核苷酸替換數(shù)。

第二豐富的種系型，PB-SRB1（序列15-35％），是最密切相關(guān)的Desulfofustis glycolicus，乙醇酸氧化硫酸鹽還原在家庭Desulfobulbaceae（圖2 B）。密切相關(guān)的PB-SRB1未經(jīng)培養(yǎng)的生物體關(guān)聯(lián)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)與參與硫氧化共生或通過(guò)硫化物氧化主導(dǎo)的環(huán)境的生物體（或化能或光養(yǎng)，圖2的B）。除了硫酸鹽的異化還原外，來(lái)自屬的分離物Desulfofustis和Desulfocapsa在外已被證明通過(guò)源性硫化物清除劑存在下元素硫和硫代硫酸鹽的歧化而生長(zhǎng)（Finster等人，1998年；Finster，2008年）。

其余的16S rRNA基因序列主要是來(lái)自海洋硅藻的葉綠體和來(lái)自門的不同系統(tǒng)發(fā)育型擬桿菌。主要系統(tǒng)發(fā)育型擬桿菌的主要屬于來(lái)自已知或疑似活性硫循環(huán)區(qū)域的環(huán)境序列進(jìn)化枝，很少有培養(yǎng)的代表（支持信息，圖S2）。對(duì)從粉紅色漿果中擴(kuò)增的18S rRNA基因序列的分析揭示了與羽狀硅藻和甲藻相關(guān)的幾種不同系統(tǒng)發(fā)育（支持信息，圖S3）。出于這項(xiàng)工作的目的，我們進(jìn)一步分析了主要漿果系統(tǒng)發(fā)育型PB-PSB1和PB-SRB1。

原位識(shí)別與空間布置

粉紅色漿果由透明外聚合物基質(zhì)中形狀不規(guī)則的粉紅色小管組成（圖1 F）。粉紅色漿果薄片的共聚焦顯微鏡顯示，這些小管以紫色硫細(xì)菌為主，被鑒定為含有可折射元素硫包裹體的自發(fā)熒光球菌（直徑2-4μm）（圖3）。這些折射性內(nèi)含物在溶劑（甲醇、乙醇）和洗滌劑（SDS、Triton X100）中不穩(wěn)定，證實(shí)了它們是細(xì)胞內(nèi)元素硫球。這些細(xì)胞還通過(guò)催化報(bào)告基因沉積-熒光原位雜交（CARD-FISH）使用GAM42a組特異性探針進(jìn)行熒光標(biāo)記，該探針與來(lái)自16S rRNA雜交Gammaproteobacteria的（Manz等，1992；支持信息，圖S4）。

圖3

切片粉紅色漿果組織的表面反射共聚焦顯微鏡。紫色硫細(xì)菌的自發(fā)熒光（激發(fā)543 nm，發(fā)射550–570 nm）以粉紅色顯示，來(lái)自可折射元素硫包裹體的反射信號(hào)以白色顯示。

PB-SRB1物種通過(guò)CARD-FISH定位，使用從16S rRNA基因庫(kù)設(shè)計(jì)的系統(tǒng)發(fā)育特異性探針（SRB-PiBe213；本研究）。SRB-PiBe213探針與3μm長(zhǎng)的桿雜交，這些桿豐富且散布在PB-PSB1細(xì)胞的密集島中（圖4）。使用靶向Deltaproteobacteria[DELTA495a-c；Lücker及其同事（2007年）]。與SRB-PiBe213探針雜交的游離細(xì)胞很少見(jiàn)（<總細(xì)胞數(shù)的1%），但可以在潮間帶水池的上覆水中檢測(cè)到（數(shù)據(jù)未顯示）。還發(fā)現(xiàn)覆蓋的池水和附近潮汐通道中的粉紅色沙塊含有球狀PSB細(xì)胞的微觀聚集體，以及與SRB-PiBe213探針雜交的桿狀細(xì)胞。最小的聚集體僅包含5-6個(gè)總細(xì)胞，而較大的微聚集體的直徑為20-50μm（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖4

使用系統(tǒng)發(fā)育特異性探針通過(guò)催化報(bào)告基因沉積-熒光原位雜交（CARD-FISH）鑒定漿果相關(guān)的PB-SRB1物種。掃描共聚焦顯微照片顯示了來(lái)自聚集體外圍附近的粉紅色漿果生物量的橫截面。該圖像是三個(gè)熒光信號(hào)的疊加：自發(fā)熒光紫硫細(xì)菌（以粉紅色顯示，激發(fā)543 nm，發(fā)射550–570 nm），來(lái)自SRB-PiBe213探針的CARD-FISH信號(hào)（以綠色顯示，Alexa 488酪胺）和DAPI核酸染色劑（以藍(lán)色顯示）。

系統(tǒng)發(fā)育多樣性的宏基因組分析

還使用未組裝的Illumina鳥(niǎo)槍宏基因組數(shù)據(jù)研究了粉紅色漿果中微生物的多樣性，這避免了聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增中固有的偏差。宏基因組數(shù)據(jù)中不同分類群的豐度和多樣性使用核糖體RNA基因序列(Meyer進(jìn)行評(píng)估et al.,2008)和保守的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因(Darling et al.,2014)。在鳥(niǎo)槍法宏基因組序列中觀察到的多樣性概括了基于PCR的調(diào)查（圖5）。一個(gè)顯著的例外是存在大量Alphaproteobacteria獵槍數(shù)據(jù)中，由代表驅(qū)動(dòng)紅細(xì)菌目（Oceanicola和Oceanicaulis物種）和紅螺菌目的。根據(jù)針對(duì)SILVA和核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目(RDP)數(shù)據(jù)庫(kù)的計(jì)算機(jī)內(nèi)特異性搜索（數(shù)據(jù)未顯示），這種差異可能是由于“通用”8F細(xì)菌引物引入的偏差，該引物無(wú)法很好地覆蓋這些訂單中的生物體。

圖5

來(lái)自16S rDNA PCR擴(kuò)增的克隆文庫(kù)與未組裝的250 bp雙端Illumina宏基因組讀數(shù)的細(xì)菌多樣性估計(jì)值的比較。宏基因組數(shù)據(jù)使用兩種不同的方法進(jìn)行分析：通過(guò)Phylosift將最大似然讀數(shù)放置到系統(tǒng)發(fā)育保守的蛋白質(zhì)編碼標(biāo)記基因（“系統(tǒng)基因組標(biāo)記”）上，或通過(guò)MG-RAST的M5RNA管道讀取與核糖體RNA基因的序列相似性。共有42 351個(gè)宏基因組讀數(shù)被歸類為細(xì)菌核糖體RNA序列，44 980個(gè)讀數(shù)被歸類為細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因。

使用共同組裝的Roche 454 Titanium和Illumina HiSeq序列數(shù)據(jù)對(duì)微生物多樣性進(jìn)行了進(jìn)一步的宏基因組分析。針對(duì)社區(qū)基因組學(xué)優(yōu)化的策略（Peng等人，2012年）用于組裝7400個(gè)大于1千堿基（kb；N50 1.6 kb，最大重疊群64 kb）的支架。宏基因組支架的聚類（參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)程序）揭示了屬于PB-PSB1（20-25倍覆蓋）和PB-SRB1（15-20倍覆蓋）的兩個(gè)明確定義的箱。這些基因組箱的覆蓋深度對(duì)應(yīng)于16S rRNA基因PCR數(shù)據(jù)中觀察到的PB-SRB1與PB-PSB1的豐度比（每1.1-1.7個(gè)PB-PSB1細(xì)胞1個(gè)PB-SRB1 RB）。這些基因組箱代表PB-SRB1和PB-PSB1的近乎完整的基因組，通過(guò)組裝序列長(zhǎng)度、編碼特征的數(shù)量和對(duì)45個(gè)單拷貝系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因的分析進(jìn)行評(píng)估（參見(jiàn)支持信息，表S1）。在本研究中，我們將這些基因組的進(jìn)一步分析重點(diǎn)放在與這些生物的硫基代謝相關(guān)的途徑上。

硫循環(huán)的宏基因組證據(jù)

為了評(píng)估漿果中硫循環(huán)生物的多樣性，我們將未組裝的宏基因組序列讀數(shù)映射到異化亞硫酸鹽還原酶基因（基因dsrAB，參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)程序）的系統(tǒng)發(fā)育，這些是氧化和還原異化硫代謝的廣泛使用的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記（洛伊等人，2008年）。大約33%與比對(duì)的dsrAB讀數(shù)序列無(wú)法通過(guò)這種方法進(jìn)行分類，可能是因?yàn)樗鼈冊(cè)醋韵到y(tǒng)發(fā)育無(wú)信息區(qū)域dsrAB基因的。大多數(shù)分類讀取被放置在Chromatiaceae(44%)或Desulfobulbaceae(13%,Supporting Information,Fig.S5)中。在這些家族中，大部分讀數(shù)被分配到Halochromatium salexigens(Chromatiaceae)和Desulfofustisglycolicus(Desulfobulbaceae)，與顯性16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育隸屬關(guān)系一致。剩余的分類讀數(shù)（總比對(duì)讀數(shù)的10%）分布在Desulfobacteraceae和Desulfotomaculum中。

為了進(jìn)一步表征粉紅色漿果硫氧化還原循環(huán)的潛力，我們從完整組裝的宏基因組數(shù)據(jù)集中確定了硫酸鹽還原和硫化物氧化的途徑。雖然在還原和氧化途徑中使用了許多相同的基因，但可以通過(guò)不同的序列和基因組背景清楚地區(qū)分同源物。通過(guò)基于獨(dú)立序列組成的分析，在與PB-PSB1分箱的支架上發(fā)現(xiàn)了所有鑒定的硫氧化基因，而硫還原基因位于PB-SRB1分箱中的支架上。PB-PSB1和PB-SRB1基因組中氧化和還原代謝途徑的詳細(xì)討論見(jiàn)支持信息S1、支持信息S2、表S2和圖S7-12

可溶性硫地球化學(xué)：物種形成、豐度和同位素組成

在缺氧過(guò)濾消毒的沼澤水中照亮的漿果微觀世界不會(huì)產(chǎn)生可通過(guò)Cline測(cè)定檢測(cè)到的硫化物（Cline，1969年），而是在兩天內(nèi)迅速消耗了1 mM添加的硫化物（圖6 A）。為了研究聚集體中的硫形態(tài)和氧化還原環(huán)境，我們使用插入大漿果（直徑約0.5厘米）的金汞合金微電極進(jìn)行了循環(huán)伏安法。從聚集體內(nèi)部測(cè)量的伏安圖顯示電位為0.85 V（相對(duì)于Ag/AgCl）的峰值，隨著電極穿入和穿出漿果而變化。該測(cè)量對(duì)應(yīng)于在內(nèi)部漿果不同點(diǎn)13和41之間μM硫化物的濃度（圖6 B;還參見(jiàn)Supporting Information,Fig.S6）。使用克拉克型硫化物微電極（Unisense，Aarhus，Denmark）在其他大漿果內(nèi)部進(jìn)行的獨(dú)立分析表明存在5–20μM的H 2 S（135–540μM的總硫化物）。到通過(guò)循環(huán)伏安法可檢測(cè)到的其他電活性物質(zhì)（例如O 2、Fe 3+、Fe 2+、Mn 2+和As 3+在漿果中沒(méi)有觀察、連四硫酸鹽、溶解/納米顆粒元素硫）。

圖6

A.在50毫升過(guò)濾消毒的沼澤水中用50個(gè)小漿果進(jìn)行微觀孵化時(shí)，通過(guò)Cline測(cè)定法測(cè)量硫化物濃度。孵育保持在14小時(shí)光照、10小時(shí)黑暗循環(huán)中。在漿果存在下的孵育過(guò)程中消耗了添加至1 mM濃度的硫化物（實(shí)線），而非生物對(duì)照顯示沒(méi)有變化（虛線）。沒(méi)有添加硫化物的微觀世界從接近0 mM的初始硫化物濃度沒(méi)有可檢測(cè)到的變化。誤差棒顯示三個(gè)生物重復(fù)孵化的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

B.對(duì)直徑約0.5厘米的粉紅色漿果內(nèi)的金汞合金電極進(jìn)行伏安掃描顯示，當(dāng)電極尖端穿透漿果時(shí)，在約-0.8 V（相對(duì)于Ag/AgCl）處出現(xiàn)與溶解硫化物相關(guān)的明顯峰。由于幾乎無(wú)法控制電極在漿果中的確切位置，因此數(shù)據(jù)并未量化硫化物的梯度，而是概述了整個(gè)聚合體中位置和相對(duì)值的變化。當(dāng)電極在周圍的水中并且沒(méi)有穿透聚集體時(shí)，收集到?jīng)]有明顯峰的實(shí)線。

為了研究漿果中硫化物的同位素組成，將大的聚集體（直徑約0.5厘米）穿在24號(hào)銀線上并孵育過(guò)夜原位（圖7A）?？扇苄粤蚧镆粤蚧y的形式沉淀在焊絲上，在每個(gè)聚集體下方留下帶有金屬光澤的黑色光澤（圖7 B）?？梢?jiàn)的硫化物積累開(kāi)始于聚集體的表面下方，最暗的硫化物沉積在聚集體的中心，證實(shí)了來(lái)自微伏安法和硫化物微傳感器的硫化物報(bào)告。隨后使用IMS 7f-GEO扇形磁場(chǎng)二次離子質(zhì)譜儀（SIMS；CAMECA，Gennevilliers，F(xiàn)rance）按照Fike及其同事（描述的方法分析了這種沉淀的硫化銀的豐度和同位素組成2009年）。沿著穿過(guò)兩個(gè)漿果的線的橫斷面顯示32 S計(jì)數(shù)（硫化物豐度）增加，δ減少34 S朝著聚集體中心（圖7 C）。在未發(fā)生可見(jiàn)硫化物沉積的情況下（即在漿果邊緣或漿果之間），32 S計(jì)數(shù)也非常低（圖7 C）。

圖7

A.將大的粉紅色漿果穿在24號(hào)銀線上并孵育原位過(guò)夜。

B.漿果內(nèi)產(chǎn)生的硫化物沉淀到金屬絲表面，形成一層AgS薄膜，可見(jiàn)漿果所在的黑色金屬光澤。SIMS7f離子微探針?lè)治鍪窃跈M斷面（25μm光斑尺寸）中進(jìn)行的，沿著導(dǎo)線穿過(guò)來(lái)自兩個(gè)不同漿果的AgS薄膜，這些漿果分別用紅色數(shù)字1和2標(biāo)記，分別顯示在面板C和D中。

光盤。y軸上共同繪制的是的硫豐度（32 S計(jì)數(shù)，紅色）和δ34沿橫斷面（x軸）每個(gè)點(diǎn)S（藍(lán)色）。垂直誤差條代表的標(biāo)準(zhǔn)誤差（n每次測(cè)量=20個(gè)循環(huán)）。漿果1和漿果2之間32 S計(jì)數(shù)接近0的區(qū)域?qū)?yīng)于導(dǎo)線上看不到深色硫化物膜的區(qū)域。圖7的SIMS數(shù)據(jù)也已在支持信息S2中提供。

的δ34沉積硫化物S范圍從聚集體邊緣的~6‰到聚集體中心的-31‰。相對(duì)于第一個(gè)漿果，沉積在橫斷面第二個(gè)漿果中心的硫化物顯示出較低的32 S計(jì)數(shù)和較少的同位素消耗（δ34 S為-20‰）（圖7 C）。潮間帶水體硫酸鹽δ34 S為+22‰；因此，這些“漿果內(nèi)”同位素值表明同位素分餾范圍從～15‰到53‰。相比之下，在附近沉積物表面孵育但未穿透漿果（例如圖中最左側(cè)的環(huán)）的銀絲7Aδ34具有-16±2‰的S（平均值±SD，n=15）沿線均勻分布。

使用通過(guò)穩(wěn)定同位素探測(cè)研究硫循環(huán)34 SO 4和nanoSIMS

為了跟蹤聯(lián)盟成員之間硫代謝和循環(huán)的活動(dòng)，將新鮮收集的粉紅色漿果與下厭氧培養(yǎng)34富含S的硫酸鹽和富含13 C的碳酸氫鹽在光照和黑暗條件。，富集34培養(yǎng)4天后S在形態(tài)獨(dú)特的PB-PSB1細(xì)胞中的很明顯（圖8A和B）。的34 S/32這些細(xì)胞中S比率大約是未標(biāo)記對(duì)照條件下觀察到的兩倍。發(fā)現(xiàn)該信號(hào)在甲醇中不穩(wěn)定（圖甲醇8 C），是一種用于定量萃取元素硫的溶劑（Ferdelman等，1997）。富集34 S IN光亮和黑暗孵育（圖中記載8 C）。

圖8

用同位素標(biāo)記的粉紅色漿果的NanoSIMS分析34富含S的硫酸鹽和富含13 C的碳酸氫鹽。

A.色相-飽和度-強(qiáng)度圖像映射34 S:32 S比率。色標(biāo)范圍從藍(lán)色（設(shè)置為在未標(biāo)記的控制條件下觀察到的基線比率(0.044)）到紅色，其中該比率相對(duì)于基線(0.08)增加了約2倍。顯示的圖像是來(lái)自聚集體外圍附近的粉紅色漿果生物量橫截面的復(fù)合八個(gè)連續(xù)30μm幀，分辨率為512×512像素。

B.來(lái)自疊加的初級(jí)離子信號(hào)的RGB合成圖像，顯示了形態(tài)獨(dú)特的紫硫細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞排列。疊加的初級(jí)離子圖像是12 C離子（藍(lán)色）、12 C 14 N（綠色）和32 S（紅色）。提供的每個(gè)質(zhì)量的基礎(chǔ)離子圖像支持信息S2中。

C.NanoSIMS計(jì)算的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的平均摻入13 C-碳酸氫鹽（x軸）和34 S-硫酸鹽（y軸）在黑暗（藍(lán)色）或12小時(shí)光/暗循環(huán)（紅色）中孵育4天的在活性硫酸鹽呼吸（三角形）或鉬酸鈉（X）抑制SRB的條件下，與未標(biāo)記的對(duì)照孵育（點(diǎn)）進(jìn)行比較。用甲醇（綠色三角形）對(duì)同位素標(biāo)記的深色孵育漿果進(jìn)行后處理。繪制的值是來(lái)自不同區(qū)域的15×15μm（淺色）或30×30μm（深色）柵格的平均值，總共七個(gè)聚合體（每個(gè)條件一個(gè)）。

D.將14 C碳酸氫鹽摻入與1 mM硫化物一起孵育1小時(shí)或4小時(shí)的五個(gè)漿果中的酸穩(wěn)定產(chǎn)品中。對(duì)熱滅活的聚集體、暗平衡聚集體和在光照下添加和不添加10 mM鉬酸鹽的聚集體進(jìn)行孵育。

積累34 S同位素標(biāo)記的似乎取決于聚集體中硫酸鹽還原生物的活性；此外鉬酸鈉（NaMoO的4），硫酸還原的抑制劑（Oremland和卡彭，1988），阻斷的摻入34 S-富集標(biāo)簽（圖8 C）。發(fā)音的34 S-富集（1100±200‰為三次重復(fù)溫育）在散裝漿果生物質(zhì)中觀察到從孵育用34 S-富集硫酸鹽，如通過(guò)元素分析儀同位素比率質(zhì)譜儀（確定支持信息，圖S13）。未標(biāo)記的對(duì)照和鉬酸鹽處理的散裝生物質(zhì)的同位素組成與直接從沼澤中取樣的天然漿果相當(dāng)（δ34 S值范圍從-15‰到-24‰）。

碳固定是光依賴性的，如通過(guò)nanoSIMS測(cè)量所評(píng)估的13 C摻入（圖8 C）和放射性標(biāo)記（14 C）碳酸氫鹽孵育測(cè)定（圖8 D）的，表明PB-PSB1作為主要生產(chǎn)者在聚合中。鉬酸孵育不影響在短期溫育（1-4 1H）碳的光依賴性固定，表明PB-PSB1不是直接由鉬酸（圖抑制8 d）。在4天的溫育，鉬酸發(fā)現(xiàn)以降低聚集體碳固定在光，這表明較長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間的治療鉬酸強(qiáng)加限制硫化物，從而降低PB-PSB1的初級(jí)生產(chǎn)力（圖8 C）。

《鹽堿地沼澤中的光養(yǎng)粉紅色貝類的微量硫循環(huán)》——概括 、介紹

《鹽堿地沼澤中的光養(yǎng)粉紅色貝類的微量硫循環(huán)》——結(jié)果

《鹽堿地沼澤中的光養(yǎng)粉紅色貝類的微量硫循環(huán)》——討論 、結(jié)論

《鹽堿地沼澤中的光養(yǎng)粉紅色貝類的微量硫循環(huán)》——實(shí)驗(yàn)步驟、致謝