以谷氨酸興奮性毒性為主要特征的神經(jīng)毒性損傷，與卒中的發(fā)生、發(fā)展，神經(jīng)元的壞死和細(xì)胞的凋亡都存在密切的聯(lián)系，卒中后的再灌注損傷成為目前亟待解決的問題。目前已證實(shí)一些神經(jīng)保護(hù)劑可減少谷氨酸的釋放，低溫也可降低谷氨酸的釋放，因此了解缺血后谷氨酸的動(dòng)態(tài)變化有助于認(rèn)識(shí)神經(jīng)細(xì)胞壞死的程度，從而為今后延緩或阻止細(xì)胞壞死提供藥物治療的評(píng)價(jià)依據(jù)。卒中后大部分患者經(jīng)受著不同程度的偏側(cè)癱瘓或運(yùn)動(dòng)障礙，皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)負(fù)責(zé)對(duì)側(cè)半身的隨意運(yùn)動(dòng)，卒中引起的對(duì)側(cè)偏癱表明病灶同側(cè)的皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)產(chǎn)生了病理改變，而皮層的損傷程度為判斷預(yù)后提供了幫助。CIRSTEA等也通過磁共振波譜證實(shí)卒中6個(gè)月后病灶同側(cè)正常顯影的灰質(zhì)中的谷氨酸濃度與肢體癱瘓程度呈正相關(guān)，因此谷氨酸的變化也有助于卒中后臨床表現(xiàn)進(jìn)程的研究，從而作為卒中預(yù)后指標(biāo)。

如今，非人靈長類動(dòng)物作為臨床前研究的重要實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)于靈長類動(dòng)物缺血后皮層谷氨酸的動(dòng)態(tài)變化尚少見報(bào)道，因此，本研究運(yùn)用電化學(xué)微電極傳感器技術(shù)檢測(cè)活體食蟹猴腦缺血過程中皮層谷氨酸水平及動(dòng)態(tài)變化，為今后進(jìn)一步探索腦缺血皮層谷氨酸動(dòng)態(tài)變化與卒中臨床表現(xiàn)的關(guān)系提供依據(jù)，旨在為谷氨酸成為治療評(píng)價(jià)及預(yù)后判斷的指標(biāo)奠定理論基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1研究對(duì)象

所用動(dòng)物來自廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)室(以下簡(jiǎn)稱靈康公司)，該實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過國際動(dòng)物評(píng)估認(rèn)證管理委員會(huì)(AAALAC)認(rèn)證。選取3只正常食蟹猴，編號(hào)為NHP1、NHP2、NHP3,NHP1為雄性，6歲，9.5 kg；NHP2為雌性，9歲，4.2 kg；NHP3為雌性，7歲，4.0 kg。本研究在靈康公司靈長類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，3只動(dòng)物分別放置在標(biāo)準(zhǔn)單籠(深×寬×高為60 cm×77 cm×75 cm)內(nèi)飼養(yǎng)，動(dòng)物房溫度22~28℃，相對(duì)濕度為30%~75%，12 h/12 h明暗交替，每日早晚兩次喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料(碳水化合物0.492 g/g，蛋白質(zhì)0.237 g/g，脂肪0.061 g/g)，中午給予1次新鮮蔬菜或水果，動(dòng)物不限制進(jìn)水。本研究方案已遞交靈康動(dòng)物倫理委員會(huì)(IACUC)審核并獲得批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1主要儀器

FAST-mkⅢ神經(jīng)遞質(zhì)實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)(美國Quanteon公司)，谷氨酸檢測(cè)電極來自美國肯塔基大學(xué)微電極技術(shù)中心。

1.2.2缺血性腦卒中模型的建立和谷氨酸實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)食蟹猴術(shù)前禁食16 h，常規(guī)麻醉，舒眠寧(0.03 mL/kg)、阿托品(0.04 mg/kg)肌注，術(shù)中持續(xù)異氟烷(1%~3%)吸入麻醉。頭部備皮，常規(guī)消毒鋪巾。將左側(cè)顴弓上緣水平線與眶外緣垂直線連線交點(diǎn)，和顱骨矢狀線與雙外耳道連線(顱骨映射線)交點(diǎn)，兩交點(diǎn)連線即為左側(cè)大腦中動(dòng)脈大致走行方向，沿該連線做一長切口，依次進(jìn)入皮膚、皮下組織、筋膜、顳肌，翻開并去掉部分顳肌，暴露顱骨，以左側(cè)顴弓上緣上側(cè)與眶外緣后側(cè)為邊界做一約20 mm×15 mm顱骨開窗(骨窗一)；在同側(cè)皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)做一約15 mm×10 mm顱骨開窗(骨窗二)。在骨窗一，沿大腦外側(cè)裂經(jīng)腦棉保護(hù)向內(nèi)游離暴露大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery，MCA)M1段，將MCA M1近端夾閉1 h后放開。在骨窗二，將谷氨酸檢測(cè)電極固定于立體定向支架上，并連接FAST-16mkⅢ神經(jīng)遞質(zhì)實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)，獲取夾閉前1 h、夾閉時(shí)1 h及夾閉放開后1 h該部位谷氨酸的持續(xù)變化，這3個(gè)時(shí)間窗內(nèi)谷氨酸檢測(cè)為連續(xù)性的，均在1次手術(shù)中完成。檢測(cè)完畢，縫合骨窗一骨瓣，骨蠟密封，保留骨窗二，關(guān)顱縫皮。在術(shù)后第1周和第2周經(jīng)骨窗二進(jìn)行谷氨酸實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)1 h，手術(shù)準(zhǔn)備與操作同前，谷氨酸檢測(cè)方法已有應(yīng)用。

1.2.3谷氨酸電化學(xué)檢測(cè)

谷氨酸電化學(xué)檢測(cè)主要分為校準(zhǔn)和檢測(cè)。每次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前對(duì)所用電極進(jìn)行檢測(cè)物(谷氨酸)、干擾物(抗壞血酸)、可能影響物(如過氧化氫、多巴胺等)比對(duì)校準(zhǔn)，獲取電極檢測(cè)限、靈敏度、特異性、濃度線性擬合(R2)等參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)參數(shù)如下(n=9)：檢測(cè)限為(1.18±0.88)μmol/L，靈敏度為(5.3±4.4)pA/(μmol·L)，谷氨酸特異性(谷氨酸氧化反應(yīng)電流/抗壞血酸還原反應(yīng)電流)為(9.7±5.7)：1，R2為(0.993 1±0.010 0)。校準(zhǔn)后將檢測(cè)電極與FAST-16mkⅢ系統(tǒng)連接置于檢測(cè)部位，便可用于檢測(cè)。

1.2.4谷氨酸檢測(cè)位點(diǎn)

選取手術(shù)同側(cè)皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)的腦回,檢測(cè)深度位于腦表面下3 mm，選取的位點(diǎn)已在類似研究中應(yīng)用，具體為耳棒：15.0~20.0 mm，中線：10.0~11.0 mm。該區(qū)域?yàn)榇竽X中動(dòng)脈供血區(qū)，支配上肢運(yùn)動(dòng)區(qū)域。

2.結(jié)果

圖1食蟹猴在夾閉MCA M1的術(shù)前、術(shù)后第1周和術(shù)后第2周的T2WI及MRA影像學(xué)表現(xiàn)

腦缺血過程中的谷氨酸變化

谷氨酸采集頻率為4 Hz，每個(gè)檢測(cè)窗各選取3段30 s檢測(cè)濃度進(jìn)行分析，每段之間相隔10~20 min，所得數(shù)據(jù)由每段檢測(cè)濃度的平均值獲得。皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)谷氨酸濃度：3只食蟹猴術(shù)前基礎(chǔ)濃度(7.7±6.1)μmol/L，夾閉MCA M1(37.8±25.2)μmol/L，夾閉放開(38.3±25.1)μmol/L；術(shù)后第1周(12.2±9.5)μmol/L；術(shù)后第2周(23.7±26.1)μmol/L。在夾閉MCA M1時(shí)或夾閉放開后較基礎(chǔ)濃度升高(t=4.200，P=0.003；t=4.25，P=0.003)，夾閉放開后較夾閉MCA M1時(shí)谷氨酸濃度變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.160，P=0.877)，術(shù)后第1周較夾閉MCA M1時(shí)或夾閉放開后谷氨酸濃度明顯下降(t=3.95，P=0.004；t=4.320，P=0.003)，術(shù)后第2周較術(shù)后第1周谷氨酸濃度變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.970，P=0.085)。

圖2食蟹猴在夾閉MCA M1后2周內(nèi)神經(jīng)功能缺損評(píng)分的變化

3.結(jié)論

本研究使用的FAST-mkⅢ系統(tǒng)，檢測(cè)頻率為1~1 000 Hz，檢測(cè)電極尖端寬度150μm。相對(duì)于微透析技術(shù)，F(xiàn)AST具有創(chuàng)傷性更小、檢測(cè)頻率更高、即時(shí)記錄等特點(diǎn)，可以檢測(cè)亞秒級(jí)的谷氨酸瞬時(shí)變化并即時(shí)記錄，幾乎不存在時(shí)間延遲效應(yīng)，能夠非常精確地反映腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的瞬時(shí)變化水平。本研究中各檢測(cè)窗還未發(fā)現(xiàn)谷氨酸濃度驟然的起伏，只是在夾閉MCA M1后出現(xiàn)過緩慢的持續(xù)上升過程。目前的不足之處在于，利用FAST系統(tǒng)進(jìn)行缺血食蟹猴清醒狀態(tài)下長期在體檢測(cè)的技術(shù)難題仍未解決。

總而言之，本研究活體檢測(cè)食蟹猴缺血過程中皮層谷氨酸的動(dòng)態(tài)變化，或許能夠?yàn)樽渲羞M(jìn)展過程中臨床表現(xiàn)的變化提供評(píng)價(jià)依據(jù)，為谷氨酸成為卒中治療和判斷預(yù)后的指標(biāo)提供可能。