研究簡介:破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨代謝是維持骨骼系統(tǒng)基本生理功能的精心策劃的過程。破骨細(xì)胞過度活躍是骨疾病的典型特征，包括骨質(zhì)疏松、腫瘤骨轉(zhuǎn)移、牙周病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的關(guān)節(jié)破壞，而破骨細(xì)胞活性過低可誘發(fā)石骨癥。破骨細(xì)胞分化障礙可導(dǎo)致骨折時(shí)骨不連、骨愈合延遲和假體松動(dòng)。為了充分利用前破骨細(xì)胞的功能，人們已經(jīng)探索了許多策略來阻止破骨細(xì)胞在前破骨細(xì)胞階段的分化，其中大多數(shù)是通過全身或局部應(yīng)用外源性細(xì)胞因子、肽、藥物和甚至基因編輯。然而由于倫理問題和臨床上未知的副作用，這些方法很難實(shí)施。研究證明，硬度增加有助于破骨細(xì)胞通過細(xì)胞骨架排列分化。然而基質(zhì)硬度調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的機(jī)制仍不清楚，需要通過體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。研究人員提出調(diào)節(jié)基質(zhì)剛度可能是準(zhǔn)確調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的策略。制備了具有不同骨組織生理硬度的水凝膠，并探討了基質(zhì)硬度如何在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞向前破骨細(xì)胞/破骨細(xì)胞的分化。結(jié)果顯示，隨著水凝膠硬度從2.43 kPa（接近骨髓生態(tài)位硬度）增加到68.2 kPa（未成熟骨組織硬度），破骨細(xì)胞形成得到促進(jìn)。從機(jī)械角度來看，隨著基質(zhì)硬度的增加，整合素β3響應(yīng)的RhoA-ROCK2-YAP信號逐漸受損，從而促進(jìn)NF-κB信號，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。由于機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)部分受損，破骨細(xì)胞分化在具有相似血管硬度的水凝膠上的破骨細(xì)胞前階段停止，導(dǎo)致破骨細(xì)胞前觸發(fā)H型血管侵襲和小鼠股骨遠(yuǎn)端缺損的骨再生。本研究工作總結(jié)了種植體硬度對破骨細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)節(jié)模式，并提出了一種調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的新策略。

Unisense氧氣微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

測量氧含量以功能評估骨缺損中的血管向內(nèi)生長。使用微電極系統(tǒng)（Unisense）來確定氧分壓。用異氟烷麻醉小鼠，然后脫毛并暴露。氧傳感器微電極（100μm）依次用飽和氧溶液和無氧溶液進(jìn)行校準(zhǔn)。然后將微電極小心地注入骨缺損處，由馬達(dá)控制器控制微電極的深度為500μm。測量骨髓腔中的氧分壓作為對照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

提出調(diào)節(jié)基質(zhì)剛度可能是調(diào)節(jié)體外和體內(nèi)破骨細(xì)胞生成的有效方法。研究發(fā)現(xiàn)增加基質(zhì)硬度通過抑制整合素介導(dǎo)的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)來促進(jìn)破骨細(xì)胞生成。值得注意的是，由于機(jī)械傳導(dǎo)部分受阻，只有具有與血管相似硬度的基質(zhì)才能促進(jìn)前破骨細(xì)胞分化，促進(jìn)血運(yùn)重建和骨再生。本研究工作為破骨細(xì)胞生成的精確調(diào)節(jié)提供了一種新策略，并使能夠進(jìn)一步開發(fā)基于基質(zhì)剛度的骨疾病策略。

圖1、具有不同硬度的GelMA水凝膠的表征。(a)紫外線交聯(lián)GelMA水凝膠制備方案。(b)通過FTIR-ATR分析明膠和GelMA的化學(xué)結(jié)構(gòu)。(c)1 H NMR(D2O)明膠和GelMA的核磁譜。粉紅色和淡粉紅色分別代表甲基丙烯酰和賴氨酸信號。(d)GelMA組成、交聯(lián)時(shí)間和每組的平均剛度。右圖顯示了代表性的壓縮應(yīng)力應(yīng)變曲線。C和T分別表示GelMA含量和交聯(lián)時(shí)間。(e)接種在水凝膠上的BMM的活/死染色顯示均勻分布，所有組中幾乎沒有死細(xì)胞。(f)通過MTT測量細(xì)胞活力(n=3)。深色虛線代表平板上細(xì)胞的活力。

圖2、H-gel促進(jìn)整合素β3表達(dá)并減弱RhoA信號傳導(dǎo)。(a)指定水凝膠上的相對機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)mRNA表達(dá)(n=3)。(b)M-gel組培養(yǎng)的破骨細(xì)胞的代表性TRAP染色圖像。對破骨細(xì)胞數(shù)量(n=6)、破骨細(xì)胞面積(n=6)和TRAP活性(n=3)進(jìn)行量化。Blebb：用blebbistatin培養(yǎng)細(xì)胞以抑制肌球蛋白II活性。Calyc：用花萼蛋白A處理細(xì)胞以激活肌球蛋白II活性。(c)具有不同硬度的水凝膠上RANKL刺激的細(xì)胞中F-肌動(dòng)蛋白（紅色）、整合素β3（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）熒光染色的代表性圖像（n=6）。(d)RANKL刺激細(xì)胞在所示水凝膠上染色的F-肌動(dòng)蛋白（紅色）、RhoA（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）的熒光顯微照片和分析。(e)在不同硬度的水凝膠上孵育BMM 3天后，用F-肌動(dòng)蛋白（紅色）、ROCK2（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）染色的細(xì)胞的代表性免疫熒光圖像和分析（n=6）。(f)F-肌動(dòng)蛋白（紅色）、RhoA（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）的免疫熒光染色和分析。將細(xì)胞在96孔玻璃板上孵育。氯化錳2、整合素激活劑。TFA，整合素抑制劑。（n=6）。(g)用所示抑制劑處理后RhoA和ROCK2的相對基因表達(dá)。

圖3、H-gel損害機(jī)械感應(yīng)，從而促進(jìn)NF-κB信號傳導(dǎo)。(a)YAP（綠色）、F-肌動(dòng)蛋白（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）染色的代表性免疫熒光顯微照片。線圖顯示黃色箭頭指示的區(qū)域的YAP和DAPI共定位。(b)YAP核定位通過核/細(xì)胞質(zhì)熒光強(qiáng)度的比率來測量。（n=6）。(c)用維替泊芬（YAP抑制劑）或二羥西定（YAP激動(dòng)劑）處理的破骨細(xì)胞的代表性TRAP染色圖像。細(xì)胞在M-gel組上孵育。(d)量化與指定試劑一起孵育的破骨細(xì)胞的數(shù)量。(e)測量TRAP活性。(f)在RANKL存在下在所示水凝膠上孵育15分鐘后，對單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞磷酸化p65的相對水平進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。(g)p-p65水平與總p65水平的量化(n=3)。(h)檢測細(xì)胞質(zhì)（GAPDH作為細(xì)胞質(zhì)加載對照）和細(xì)胞核（p84作為核加載對照）中的NFATc1水平，并(i)進(jìn)行定量(n=3)。(j)RANKL刺激的BMM中F-肌動(dòng)蛋白（紅色）、p-p65（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）的代表性免疫熒光染色。西立伐他汀，RhoA抑制劑。水仙環(huán)素，RhoA激活劑。(k)p-p65熒光強(qiáng)度的量化，標(biāo)準(zhǔn)化為細(xì)胞大小(n=6)。(l)在H-gel上與M-CSF和RANKL一起孵育3天后，用所示抑制劑處理細(xì)胞過夜，然后進(jìn)行TRAP活性測量。

圖4、抑制力傳導(dǎo)促進(jìn)骨膜上破骨細(xì)胞的生成。(a)骨膜注射西立伐他汀和RANKL的圖示。治療1周后，取出股骨并用TRAP和YAP染色以評估力轉(zhuǎn)導(dǎo)和破骨細(xì)胞發(fā)育。(b)代表性TRAP染色圖像，右圖顯示西立伐他汀組中黑色輪廓區(qū)域的放大。(c)骨膜骨表面前破骨細(xì)胞和(d)多核破骨細(xì)胞的定量(n=6)。(e)TRAP（紫色）、YAP（綠色）和DAPI（藍(lán)色）的代表性免疫染色圖像。CB和P代表皮質(zhì)骨和骨膜。(f)骨膜上YAP+細(xì)胞的數(shù)量(n=6)。(g)TRAP+的數(shù)量骨膜上的細(xì)胞(n=6)。(h)RANKL處理的骨膜的TRAP染色圖像，右圖顯示RANKL組中黑色輪廓區(qū)域的放大。(i)骨膜骨表面上的前破骨細(xì)胞和(j)破骨細(xì)胞的定量(n=6)。P和C分別代表骨膜和皮質(zhì)骨。

圖5、M-gel通過前破骨細(xì)胞促進(jìn)血管生成和骨生成。(a)骨缺損血管造影的代表性圖像。(b)容器表面的量化(n=6)。(c)血管體積的相對定量(n=6)。(d)植入8周后，通過尖端直徑為100μm的微電極（Unisense，丹麥）測量骨缺損中的氧分壓張力（n=6）。虛線代表正常骨髓中的氧分壓。(e-f)CD31（綠色）、內(nèi)粘蛋白（Emcn）和DAPI（藍(lán)色）的代表性免疫染色圖像和分析。具有CD31 hi Emcn hi（黃色）的細(xì)胞代表植入2周后的H型血管（n=6）。(g–h)流式細(xì)胞術(shù)圖和CD31 hi Emcn百分比分析hi內(nèi)皮細(xì)胞(n=6)。(i–j)Emcn（紅色）、Osterix（綠色）和DAPI（藍(lán)色）的免疫染色。骨修復(fù)2周后對Osterix+細(xì)胞進(jìn)行定量(n=6)。(k–l)用TRAP（紅色）、PDGF-BB（綠色）和DAPI（藍(lán)色）染色的免疫熒光圖像。植入2周后骨缺損骨表面PDGF-BB+和TRAP+細(xì)胞數(shù)量的定量(n=6)。(m)植入2周后骨缺損中的PDGF-BB水平和(n)VEGF水平(n=6)。

結(jié)論與展望

破骨細(xì)胞普遍參與骨穩(wěn)態(tài)，其異常會導(dǎo)致骨疾病，例如骨質(zhì)疏松癥。由于破骨細(xì)胞的不受控制的管理，當(dāng)前的生化信號分子臨床策略經(jīng)常擾亂先天骨代謝。因此迫切需要一種精確調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的替代策略。為此，本研究提出了一個(gè)假設(shè)，即機(jī)械刺激可能是一種潛在的策略。在這里本論文研究人員創(chuàng)建了一種水凝膠來模仿生理骨骼微環(huán)境，其剛度范圍為2.43kPa至68.2kPa。徹底研究了基質(zhì)剛度對破骨細(xì)胞行為的影響。結(jié)果表明，基質(zhì)硬度可用于在體外和體內(nèi)指導(dǎo)破骨細(xì)胞的命運(yùn)。特別是增加的基質(zhì)硬度抑制了整合素β3響應(yīng)的RhoA-ROCK2-YAP相關(guān)的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)并促進(jìn)破骨細(xì)胞生成。值得注意的是，中等硬度水凝膠（M-gel）具有與血管相同的剛度（范圍為17.5 kPa至44.6 kPa），通過部分抑制力傳導(dǎo)來促進(jìn)前破骨細(xì)胞發(fā)育，從而促進(jìn)骨缺損小鼠的血運(yùn)重建和骨再生。此研究工作提供了一種通過選擇最佳基質(zhì)剛度來精細(xì)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的創(chuàng)新方法。