研究簡(jiǎn)介:子癇前期是一種嚴(yán)重的妊娠并發(fā)癥，其特征之一是高血壓和蛋白尿。循環(huán)中可溶性fms樣酪氨酸激酶-1（sFlt-1）水平的升高被認(rèn)為是導(dǎo)致這些癥狀的主要原因之一。sFlt-1是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）受體的可溶性分泌形式，能夠作為VEGF和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（PlGF）的拮抗劑，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。硫化氫是一種內(nèi)源性氣態(tài)信號(hào)分子，與多種生理和病理過(guò)程有關(guān)，包括血管擴(kuò)張、血管生成和炎癥。胎盤(pán)組織能夠產(chǎn)生H2S，而H2S的產(chǎn)生與γ-半胱氨酸裂解酶（CSE）和β-半胱氨酸合成酶（CBS）等酶的活性有關(guān)。除了已知的CSE和CBS，3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶（3-MST）也在人類胎盤(pán)中被發(fā)現(xiàn)，并且主要定位于合胞滋養(yǎng)細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，H2S能夠抑制胎盤(pán)中sFlt-1的釋放。本研究進(jìn)一步探討了內(nèi)源性H2S對(duì)sFlt-1生成的影響，以及在胎盤(pán)中發(fā)揮作用的H2S生成酶。miR133b是一種小RNA分子，參與了H2S抑制sFlt-1生成的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，H2S處理能夠降低sFlt-1 mRNA的半衰期，并增加miR-133b的表達(dá)。本研究旨在闡明內(nèi)源性H2S如何影響sFlt-1的生成，并探討了miR133b在這一過(guò)程中的作用，以及H2S生成酶在胎盤(pán)中的表達(dá)和功能。


Unisense微呼吸系統(tǒng)的應(yīng)用


將約100毫克的胎盤(pán)組織或培養(yǎng)細(xì)胞樣本放入含有蛋白酶抑制劑，2毫摩爾苯甲基磺酰氟、1毫摩爾正釩酸鈉和10毫克/毫升阿普羅寧)的PBS中，置于冰浴上。組織勻漿后在4℃溫度下離心，然后收集上清液。使用微型H2S微呼吸電極(H2S-MRCh型，Unisense，丹麥)和Unisense PA2000放大器測(cè)定H2S生成的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)(Zhu等，2013年)。簡(jiǎn)而言之，測(cè)量是在溫控微呼吸系統(tǒng)(Unisense)中進(jìn)行的。傳感器信號(hào)穩(wěn)定后，加入L-半胱氨酸(1mmol/L)和產(chǎn)生H2S的輔助因子吡哆醛-50-磷酸(PLP，1mmol/L)。然后在每個(gè)痕量的最初最陡斜坡處測(cè)定H2S生成率。


實(shí)驗(yàn)結(jié)果


研究獲得的RIA、NKA豐度、rOCR和長(zhǎng)度缺乏差異表明，白鱸幼蟲(chóng)能夠應(yīng)對(duì)OA，而在暴露于OA時(shí)，離子傳輸能力、能量消耗或生長(zhǎng)不會(huì)發(fā)生重大變化。預(yù)計(jì)下個(gè)世紀(jì)的pCO 2會(huì)升高（~2000μatm）。然而，深入的分析為潛在的新效應(yīng)提供了線索，例如離子細(xì)胞大小的變化，并有助于確定需要對(duì)海洋魚(yú)類幼蟲(chóng)的基本生理學(xué)、它們響應(yīng)OA和多重應(yīng)激源的能量分配以及通過(guò)親本效應(yīng)、發(fā)育可塑性和自然選擇實(shí)現(xiàn)跨代適應(yīng)的潛力。這凸顯了根據(jù)急性實(shí)驗(yàn)室研究來(lái)確定OA對(duì)海洋生物的潛在影響的難度。

圖1、CBS、CSE和3-MST在人類胎盤(pán)中的表達(dá)。A-F：免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示了健康胎盤(pán)和子癇前期胎盤(pán)中CBS(A&D)、CSE(B&E)和3MST(C&F)陽(yáng)性染色的代表性切片。G-I為陰性對(duì)照切片，使用的一抗與過(guò)量10倍的相應(yīng)阻斷肽(G&H)或IgG(I)預(yù)孵育。

圖2、健康胎盤(pán)和子癇前期胎盤(pán)中的3-MST含量和H2S生成率。胎盤(pán)組織取自健康孕婦(n=23)和子癇前期孕婦(n=19)。A：通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)3-MST的mRNA水平。B：用Western印跡法測(cè)定3-MST的蛋白水平。具有代表性的蛋白條帶顯示在相應(yīng)直方圖的頂部。C，正常胎盤(pán)和子癇前期胎盤(pán)的H2S生成率。上圖為胎盤(pán)組織勻漿中H2S生成的代表性痕跡。下圖為正常胎盤(pán)和子癇前期胎盤(pán)中H2S生成率的累積數(shù)據(jù)。

圖3、H2S調(diào)節(jié)人胎盤(pán)細(xì)胞中sFlt-1的產(chǎn)生。A和B，NaHS和L-半胱氨酸對(duì)培養(yǎng)的胎盤(pán)細(xì)胞中sFlt-1生成的影響。用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定培養(yǎng)基中sFlt-1蛋白水平。實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中sFlt-1的mRNA水平。C，L-半胱氨酸對(duì)敲除CBS或CSE的細(xì)胞中sFlt-1生成的影響。用對(duì)照siRNA、CBS siRNA或CSE siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后用L-半胱氨酸(2×10-3M)處理24小時(shí)。

圖4、H2S對(duì)sFlt-1穩(wěn)定性和miR-133b表達(dá)的影響。A&B，mRNA抑制劑DRB對(duì)NaHS(A)和L-半胱氨酸(B)處理的滋養(yǎng)細(xì)胞中sFlt-1 mRNA表達(dá)的影響。用NaHS(8×10-5M)或L-半胱氨酸(2×10-3M)預(yù)處理胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞12小時(shí)，然后用DRB(25×10-6M)處理。之后在指定的時(shí)間點(diǎn)分離總RNA，并通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)mRNA的穩(wěn)態(tài)水平。18S-RNA用作負(fù)載對(duì)照。C&D，NaHS(C)和L-半胱氨酸(D)對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞中miR-133b表達(dá)的影響。用不同濃度的NaHS處理細(xì)胞24小時(shí)，然后收獲細(xì)胞測(cè)定miR133b的水平。

圖5、Flt-1是miR-133b的直接靶標(biāo)。A，miR133b的模擬物對(duì)胎盤(pán)細(xì)胞中sFlt-1基礎(chǔ)水平的影響。細(xì)胞中sFlt-1的mRNA水平和培養(yǎng)基中sFlt-1的蛋白濃度分別通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR和ELISA法測(cè)定。B，miR133b抑制劑對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞中sFlt-1基礎(chǔ)水平的影響。C，sFlt-1 3’UTRs中預(yù)測(cè)的miR-133b靶序列及其3’UTRs中的突變核苷酸。D，含有sFlt-1 3’UTR及其突變核苷酸的熒光素酶檢測(cè)報(bào)告。在沒(méi)有或存在miR133b模擬物的情況下，用上述報(bào)告物轉(zhuǎn)染胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞。使用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量細(xì)胞裂解物中的熒光素酶活性。


結(jié)論與展望


胎盤(pán)中可溶性fms樣酪氨酸激酶-1(sFlt-1)的分泌增加是導(dǎo)致子癇前期的主要原因之一。之前的研究表明，硫化氫(H2S)能抑制胎盤(pán)中sFlt-1的釋放。在本研究中，研究人員試圖探究?jī)?nèi)源性H2S是否會(huì)影響sFlt-1的生成，并闡明是哪種H2S生成酶在胎盤(pán)中發(fā)揮了作用。研究發(fā)現(xiàn)除了β-半胱氨酸合成酶(CBS)和γ-半胱氨酸裂解酶(CSE)外，3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-MST)也在人類胎盤(pán)中被發(fā)現(xiàn)，并且主要定位于合胞滋養(yǎng)細(xì)胞。3-MST在先兆子癇胎盤(pán)和正常胎盤(pán)中的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。用NaHS和L-半胱氨酸處理培養(yǎng)的合胞滋養(yǎng)細(xì)胞可抑制sFlt-1 mRNA的表達(dá)，并導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基中的sFlt-1蛋白含量下降。用CBS siRNA和CSE siRNA轉(zhuǎn)染合胞滋養(yǎng)細(xì)胞可逆轉(zhuǎn)L-半胱氨酸的上述作用。此外NaHS和L-半胱氨酸處理降低了sFlt-1 mRNA的半衰期，增加了靶向sFlt-1的miR-133b的表達(dá)。MiR-133b在先兆子癇胎盤(pán)中表達(dá)下調(diào)，并與CBS和CSE水平相關(guān)。Unisense微呼吸系統(tǒng)被用來(lái)實(shí)時(shí)測(cè)量胎盤(pán)組織或培養(yǎng)細(xì)胞樣本中硫化氫（H2S）的產(chǎn)量，并能夠精確地測(cè)量和分析胎盤(pán)組織和細(xì)胞中H2S的產(chǎn)生情況，這對(duì)于理解H2S在胎盤(pán)功能和子癇前期發(fā)展中的作用至關(guān)重要。這些結(jié)果表明，H2S是胎盤(pán)中產(chǎn)生sFlt-1的重要調(diào)節(jié)因素。本論文的結(jié)論強(qiáng)調(diào)了H2S在胎盤(pán)中作為sFlt-1生成的重要調(diào)節(jié)因素，以及CSE和CBS表達(dá)量的減少可能是導(dǎo)致先兆子癇胎盤(pán)中sFlt-1生成量升高的原因之一。為理解子癇前期的分子機(jī)制提供了新的見(jiàn)解，并可能有助于開(kāi)發(fā)預(yù)防和治療這一妊娠并發(fā)癥的新策略。