研究簡(jiǎn)介：木質(zhì)纖維素(cellulose)是由葡萄糖組成的大分子多糖。不溶于水及一般有機(jī)溶劑。甲殼動(dòng)物蛀木水虱危害木船和碼頭木質(zhì)設(shè)施，俗稱“吃木蟲”。研究發(fā)現(xiàn)蛀木水虱有一定的益處，其體內(nèi)含有一種特殊的酶，有助于將木頭分解為生物能源。蛀木水虱體內(nèi)并沒(méi)有幫助消化木質(zhì)的微生物，研究人員發(fā)現(xiàn)完全靠自己將木質(zhì)纖維素分解為糖分。本論文主要就甲殼動(dòng)物蛀木水虱中存在的血液蛋白酶如如何實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)纖維素的消化，了解其體內(nèi)存在的蛋白酶對(duì)纖維素水解的機(jī)理，從而將有助于科學(xué)家們?cè)O(shè)計(jì)出更強(qiáng)大的酶用于工業(yè)生產(chǎn)。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

unisense公司的pH電極和氧氣微電極應(yīng)用于動(dòng)物腸道內(nèi)的pH測(cè)試及氧濃度的測(cè)試。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，蛀木水虱用針刺頭和針固定在瓊脂糖板上(上覆有海水)。在鑷子的幫助下，切除蛀木水虱胸椎節(jié)段，露出了蛀木水虱后腸，使用尖端直徑為25μm的pH值微電極和尖端直徑為10μm氧氣微電極(Unisense、丹麥)對(duì)蛀木水虱的上腸腔到后腸腔內(nèi)的氧氣和pH進(jìn)行了測(cè)試。傳感器尖端被引入信號(hào)穩(wěn)定后記錄下腸組織內(nèi)部不同區(qū)域的pH值和氧濃度值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

木質(zhì)(木質(zhì)纖維素)植物是一種豐富的可再生原料，富含多糖與木質(zhì)素結(jié)合成不溶性纖維的復(fù)合材料。海洋甲殼類動(dòng)物林棲動(dòng)物屬的伐木工是少數(shù)能以這種食物為生而不依賴腸道寄生菌群的動(dòng)物之一。糞便顆粒分析說(shuō)明蛀木水虱以含己糖的多糖(主要是纖維素)為目標(biāo)與消化系統(tǒng)中纖維素酶的豐富程度相對(duì)應(yīng)，但是木蘭和木質(zhì)素基本未被消耗。研究證明了蛀木水虱的呼吸蛋白，血藍(lán)蛋白，在木材被消化的后腸中含量豐富，與木材一起孵育血藍(lán)蛋白通過(guò)纖維素酶顯著提高其消化率，并對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行了修飾。我們提示血藍(lán)蛋白的這種活性對(duì)蛀木水虱的攝食能力是有幫助的沒(méi)有腸道共生體的木材。這些發(fā)現(xiàn)可能會(huì)帶來(lái)創(chuàng)新木質(zhì)纖維素生物煉制。

圖1、柳樹木主要生物高分子組成成分的消化前后。圖a表示的是蛀木水虱的糞便顆粒掃描電鏡(尺寸-50μm)。b從木材(柳樹，N=10)和糞球(糞便78%，為消化過(guò)程中的質(zhì)量損失，N=8）組分包括乙酰溴化的可溶性木質(zhì)素(藍(lán)色)、TFA-可溶性半纖維素(紅色)和硫酸酸性的可溶性纖維素(橙色)。圖c表示的是木材纖維素組分消化前(柳樹,N=11;(暗橙色)的單糖組成(絕對(duì)含量）和消化后(糞便78%，消化過(guò)程中歸一化的質(zhì)量損失，N=8;淡橙色)在使用三氟乙酸（TFA）水解后，連續(xù)H2SO4水解進(jìn)行的分析。d木材半纖維素組分單糖組成(絕對(duì)含量)(柳樹N=11;消化后(糞便78%，歸一化為消化過(guò)程質(zhì)量損失，N=10;淡紅色)TFA水解分析。圓圈表示樣本值。Fuc,海藻糖,Ara,阿拉伯糖;Rha,鼠李糖;半乳糖;Glu、葡萄糖;Xyl,木糖;,甘露糖;GalA,半乳糖醛酸。

圖2、蛀木水虱的消化系統(tǒng)組成示意圖。圖a表示的是蛀木水虱側(cè)面示意圖(通常2-3mm長(zhǎng))，圖中顯示兩個(gè)雙葉肝胰酶(Hp)中的一個(gè)，連接了管狀腸的前部;流形(M)和過(guò)濾系后統(tǒng)(FS)位置如圖所示，后腸部分食物質(zhì)量為暗色，腸道不同測(cè)量位置點(diǎn)的pH值。B腸道的幾丁質(zhì)角質(zhì)層內(nèi)襯的掃描電子顯微照片(比例尺寸、5μm)。圖C表示的是脾肝胰腺細(xì)胞微絨毛(Mv)的肝胰腺內(nèi)腔的透射電子顯微照片(比例尺寸,2μm)。圖D表示的是應(yīng)用微電極測(cè)試蛀木水虱后腸(腸)區(qū)域，蛀木水虱身體區(qū)域及進(jìn)入周圍加入的海水中的氧濃度(尺寸的規(guī)模0.5 mm)。

圖3、蛀木水虱消化過(guò)程蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和天然血青素提取物。圖a表示的是蛀木水虱后腸液中糖基水解酶(GH)家族相對(duì)豐度的測(cè)定。圖b表示的是蛀木水虱的后腸血青蛋白相對(duì)豐度通過(guò)血青蛋白相對(duì)摩爾百分比的比較，分為組織(包括固體含量)和液體部分。圖c表示的是從蛀木水虱克隆的GH家族5、7、9各2個(gè)成員的相對(duì)基因表達(dá)差異。圖d表示的是蛀木水虱內(nèi)的4個(gè)血青蛋白基因的相對(duì)表達(dá)差異。圖e表示的是蛀木水虱體內(nèi)的血藍(lán)蛋白的凝膠（SDS-PAGE）電泳圖。圖f表示的是經(jīng)陰性醋酸鈾酰染色的天然蛀木水虱中血藍(lán)蛋白的提取物的TEM圖像顯示。

圖4、焦糖醇和分離木質(zhì)素的血青苷活性。圖a表示的是變色菌屬蟲漆酶與活化的在以NaPO4、pH為6.8，含有1nm的焦棓酸培養(yǎng)孵化的血藍(lán)蛋白的紫外-可見光譜圖。圖b表示的是堿木質(zhì)素(3%)在海水(SW，黑色)或含血藍(lán)蛋白(Hc，紅色）經(jīng)1h孵育后的13C固相核磁共振13C譜圖。

圖5、室溫下短血藍(lán)蛋白預(yù)處理后楊柳樹木的消化率。其中楊柳消化率測(cè)定采用的是生物量預(yù)處理糖化反應(yīng)中每單位生物量釋放纖維二糖(nmol)的量(mg)。預(yù)處理包括在海上中對(duì)血藍(lán)蛋白的預(yù)處理（Hc暗紅色）、單獨(dú)的海水處理（SE淡藍(lán)色）、沒(méi)有處理（藍(lán)色）和使用了50mM DTPA（螯合劑）處理（淡紅色）。圖b表示的是應(yīng)用CBH I進(jìn)行糖化后的紅褐肉座菌(HjCBHI)。水解產(chǎn)物是根據(jù)分析HPAEC中纖維低聚物標(biāo)準(zhǔn)。所獲得的數(shù)值是對(duì)預(yù)處理后沒(méi)有CBH的反應(yīng)進(jìn)行歸一化，來(lái)反映血青苷的制備過(guò)程中剩余的纖維素酶活性。

結(jié)論與展望

英國(guó)約克大學(xué)、樸次茅斯大學(xué)以及美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家使用先進(jìn)的生物化學(xué)分析方法和微電極技術(shù)，找出了蛀木水虱體內(nèi)能分解木頭的酶并揭示了其結(jié)構(gòu)和功能。在研究過(guò)程中，研究人員為了充分了解蛀木水虱體內(nèi)蛋白酶分解木質(zhì)纖維素的的機(jī)理，應(yīng)用unisense公司的氧氣及pH微電極成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)甲殼動(dòng)物蛀木水虱體內(nèi)的腸道組織內(nèi)的氧氣及pH實(shí)現(xiàn)了原位的測(cè)試，由于該微電極具有空間精度高（尖端直徑為25um或10um）、測(cè)試相應(yīng)速度快（2s），很好的幫助科研人員對(duì)活體的甲殼動(dòng)物蛀木水虱體內(nèi)的相關(guān)環(huán)境（pH/氧濃度等）進(jìn)行了原位測(cè)試，從而更好的了解蛀木水虱體內(nèi)存在的這種分解木質(zhì)纖維素酶的工作原理，很好的揭示了其結(jié)構(gòu)和功能，成功的揭示了纖維素鏈如何被消化成葡萄糖。該研究結(jié)果將有助于科學(xué)家們?cè)O(shè)計(jì)出更強(qiáng)大的酶用于工業(yè)生產(chǎn)，這說(shuō)明微電極在研究關(guān)于地將廢紙、舊木材和稻草等廢物變成液體生物燃料領(lǐng)域存在很好的應(yīng)用前景。