背景介紹:隨著水體的富營養(yǎng)化，帶有微藻附生生物膜的海草葉過度生長會增加，由于包括農(nóng)業(yè)在內的土地徑流加速，這在沿海水域中是一個日益嚴重的問題。富營養(yǎng)化的增加會導致海草葉片的附生植物過度生長，這對沿海水域的海草健康構成了重大威脅。然而對于附生植物如何影響海草葉球的關鍵生物地球化學條件和過程知之甚少。本論文的研究人員使用電化學微傳感器來測量裸露和附生植物覆蓋的海草葉表面的O2，pH和CO2的微梯度濃度，以確定附生植物對葉片化學微環(huán)境的影響。研究人員使用unisense的微電極剖面分析系統(tǒng)測量來確定附生生物膜對大葉藻葉片微環(huán)境中關鍵物理化學條件和過程的影響。研究表明在沒有和有附生微藻生物膜的情況下，首次實現(xiàn)了直接測量在沒有和有附生微藻生物膜的海草葉片表面二氧化碳濃度和動態(tài)的直接測量，并與pH和O2的微剖面濃度測量相結合。這對附生植物對海草葉球微環(huán)境的影響的詳細測定是非常新穎的，并且使人們能夠洞察富營養(yǎng)化引起的附生植物過度生長下海草光合作用的關鍵調控機制。

Unisense微電極分析系統(tǒng)的應用

使用unisense的Clark型O2微型傳感器（OX-10，尖端直徑10μm，響應時間（1-3 s），用于測量從水到葉片組織表面的O2濃度曲線。pH微電極（pH-50，尖端直徑50μm）測量從水到葉片表面的pH分布。在三個pH緩沖液（pH 4、7和10）中根據(jù)信號讀數(shù)對pH微電極進行線性校準，pH微電極與浸沒在流動室中的參比電極（REF-RM；Unisense A/S，丹麥）結合使用。新型的Clark型CO2微電極傳感器（尖端直徑為20–100μm，檢出限<0.5μM，響應時間為160s）用于測量葉片表面的CO2濃度。CO2微電極傳感器在預先吹掃過的氮氣（N2）超純水，酸性（pH<4）超純水和已知CO2濃度（即0、37、74和111μM）的超純水水中進行線性校準（四點）。

所有微電極傳感器都連接到unisense主機上，并安裝在電動微操縱器（MM332）上。在進行微剖面濃度分析之前，通過手動操作微操縱器將微傳感器定位在葉片表面，同時用立體顯微鏡觀察微傳感器的尖端和葉片組織表面。當微傳感器尖端接觸到植物組織表面時，葉片略有移動。其中O2微電極的移動步徑為50μm，pH、O2微電極的移動步徑為50μm，CO2的移動步徑為為100μm。由于CO2微型傳感器的響應時間相對較長，因此在厚附生層中選擇了200μm步徑。剖面測量從葉片表面上方2–3 mm的混合水柱開始（取決于DBL的厚度和附生生物膜的厚度）朝向葉片組織的表面。為了在微剖面分析時確保穩(wěn)態(tài)條件，當改變光照條件時，將微電極傳感器放置在葉片表面，并隨時間跟蹤微傳感器信號，直到達到新的穩(wěn)定信號為止（大約45分鐘）。

實驗結果

附生植物生物膜會導致pH，O2的極端波動，而海草葉片表面無機碳濃度嚴重影響了植物的生長性能。在光照條件下，葉片附生生物膜及其擴散邊界層會導致強堿化作用，顯著降低葉片表面的CO2和HCO3可用性，導致碳限制和光呼吸作用增強導致光合效率降低。對于附生植物，葉片表面的pH值增加到>10，從而超過最終pH值平均水平（?9.62）和活性光合作用的CO2補償點。在黑暗中，附生生物膜導致CO2增加葉片表面缺氧。附生植物會導致海草中嚴重的碳限制，這是由于葉球堿化作用強烈，導致二氧化碳消耗和昂貴但限制了HCO3-的利用，增加了植物饑餓的風險。

圖1、微電極系統(tǒng)測試大葉藻葉片的表面的實驗裝置圖。（a）實驗裝置的圖像顯示無附生植物生物膜和有附生生物植物膜的海草（Z.marina L.）葉片效果圖，以及Clark型O 2微電極傳感器的尖端。（b）概念圖表示的是穿過擴散邊界層(DBL)和附生海草生物膜的O 2，CO2，HCO3-，pH剖面，以及假設附生植物在光照下對葉片微環(huán)境堿化的影響，從而對海草光合作用的無機碳（CI）有效性的影響。在這里，從海水到海草葉表面的總擴散距離（TDD）等于附生生物膜和真實DBL的總厚度（即生物膜/海水界面處稀薄的未攪拌水層）。

圖2、在沒有附生生物膜和有附生生物膜的葉狀球的海草的化學參數(shù)（O2、CO2、pH）微梯度。在入射光子輻照度(400-700 nm)為0、30和300 mol光子?m-2?s-1的情況下，測量/計算了葉片表面的O2、CO2和pH的垂直濃度剖面(以及推導出的HCO3‐的濃度剖面)。黑色符號和線條表示沒有附生植物覆蓋的葉子（裸露的對照葉子；?附生植物）。紅色符號和線條表示帶有附生植物覆蓋物（+附生植物）的葉子。零距離（y=0）表示葉片組織表面?？倲U散距離的厚度確定為真實擴散邊界層中線性O 2濃度梯度與外推的散裝水O 2濃度相交的位置（圖1；在黑暗中和在300 mol光子?m-2?s–1下的O 2測量值之間的平均值?m?2?s-1，表示附生生物膜的大致厚度（黑色虛線；總擴散距離）。

圖3、葉片附生生物膜對大葉藻葉片表面化學微環(huán)境的影響（a和b）選定的微剖面顯示了O2（黑色），CO2（藍色），pH（紅色）的垂直濃度的動態(tài)變化），以及所估計的HCO3-（綠色）。在入射光子輻照度(400-700 nm)為0、30和300 mol光子?m-2?s-1的情況下，測量計算了葉片表面的O2、CO2和pH的垂直濃度剖面(以及推導出的HCO3‐的估計濃度剖面)?？倲U散距離的厚度確定為真實擴散邊界層中線性O 2濃度梯度與外推的散裝水O 2濃度相交的位置。

圖4、附生植物誘導海草宿主的大葉藻微環(huán)境動力學。在無附生生物膜和有附生生物膜的大葉藻葉片組織表面測量的pH值和O2、CO2和HCO3濃度的動態(tài)范圍，在光子照射(400-700 nm)強度從0-300 mol光子?m-2?s–1，黑條表示沒有附生植物覆蓋的葉子（裸露的對照葉子；?附生植物）。紅色條代表帶有附生植物覆蓋物（+附生植物）的葉子。

圖5、附生生物膜厚度對pH值和無機碳有效性的影響。大葉藻葉片表面的CO2濃度和估算的HCO3‐?？倲U散距離的厚度被確定為真正擴散邊界層中線性的O2濃度梯度與外推的體積水O2濃度之間的距離。在0(黑色符號)、30 umol光子?m-2?s–1(藍色符號)和300 umol光子?m-2?s–1(紅色符號)的摩爾光子輻射下，測量了海草葉片表面pH值和CO2和HCO3‐濃度對擴散距離的響應。

結論與展望

研究人員通過使用unisense的微電極剖面分析系統(tǒng)測量來確定附生生物膜對大葉藻葉片微環(huán)境中關鍵物理化學條件和過程的影響。使用unisense微電極傳感器來測量裸露和附生植物覆蓋的海草葉表面的O2，pH和CO2的微梯度，以確定附生植物對葉片化學微環(huán)境的影響。研究了在沒有和有附生微藻生物膜的情況下，首次實現(xiàn)了直接測量在沒有和有附生微藻生物膜的海草葉片表面CO2濃度和動態(tài)的直接測量，并與pH和O2的微剖面濃度測量相結合。這種對附生植物對大葉藻葉球微環(huán)境的影響的詳細測定，該研究使研究人員能夠洞察富營養(yǎng)化引起的附生植物過度生長下海草光合作用的關鍵調控機制。