甲烷是重要的化工原料和化學(xué)能源，在人類的生產(chǎn)生活中扮演著重要的作用，但是甲烷又是地球大氣中僅次于二氧化碳的第二號溫室氣體。甲烷引起的室效應(yīng)是同等質(zhì)量二氧化碳的20~30倍。甲烷氧化菌是以甲烷作為生長的唯一碳源和能源的微生物。廣泛存在于泥土、沼澤、稻田、河流、湖泊、森林和海洋中。甲烷氧化菌在溫室氣體控制（吸收甲烷）、環(huán)境保護(hù)和工業(yè)生物催化中的重要地位，世界各國的科研機(jī)構(gòu)對甲烷氧化菌及其相關(guān)酶系的研究日益增多。本論文分離出一種疣微菌門甲烷氧化菌，通過基因編碼解析出這類甲烷氧化菌的基因，并且研究該類甲烷氧化菌是如何應(yīng)用地?zé)崮茉粗械臍錃夂图淄閷?shí)現(xiàn)異養(yǎng)和自養(yǎng)生長的。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

在生物反應(yīng)器中應(yīng)用了unisense氧氣微電極和氫氣微電極測試了甲烷氧化菌生長時，體系中的氫氣和氧化的消耗情況。其中體系中的氫氣和氧氣的濃度消耗是直接將氧微電極或氧微電極是直接插入細(xì)胞培養(yǎng)液環(huán)境中測試完成的。其中微電極的矯正采用了兩點(diǎn)法完成的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)疣微菌門甲烷氧化菌的生長是基于混合營養(yǎng)體法，該甲烷氧化菌是從酸性地?zé)崽锿寥乐蟹蛛x獲得疣微菌門甲烷氧化菌RTK17.1菌株，該類菌株含有氧化氫氣的酶結(jié)構(gòu)，通過基因組分析證實(shí)，這種菌株編碼了兩種[NiFe]-氫化酶，生化試驗(yàn)表明該菌能夠利用氫作為有氧呼吸和碳固定過程中的電子供體進(jìn)行生長。這類甲烷氧化菌生長是夠通過在地?zé)豳Y源中利用氫和甲烷來滿足能量和碳的需求，并且其所需的營養(yǎng)液是動態(tài)變化的，這也說明了這種混合營養(yǎng)的生活方式很可能促進(jìn)了這些微生物所占據(jù)的生態(tài)位空間的擴(kuò)展，導(dǎo)致它們在地?zé)嵊绊懕韺油寥乐蟹植驾^多。

圖1、新西蘭地?zé)崽镏屑淄?、氫氣氧化的地球化學(xué)、生化和分子特征。圖a)表示的是不同溫度下，不同深度土壤的溫度和pHf分布情況。圖b表示的是土壤不同深度處甲烷、氫氣和氧氣混合比例。圖c表示的是不同溫度下，土壤表面甲烷氧化過程隨時間的變化過程。圖d表示的是不同溫度下，土壤表面氫氣氧化隨時間變化的過程。圖e表示的是不同土壤深度下甲烷氧化菌的種群結(jié)構(gòu)分布情況。圖f表示的是不同深度下土壤中疣微菌門甲氧化菌的基因編碼分布情況，具體指的是中疣微菌門甲氧化菌中有氧吸收氫化酶和顆粒狀甲烷單加氧酶的分布情況。

圖2、嗜酸的甲烷氧化菌株（sp.RTK17.1）的氫氣氧化驅(qū)動的需氧呼吸及二氧化碳固定過程，圖a表示的是使用細(xì)胞生物氧化器培養(yǎng)細(xì)胞過程中的氫氣實(shí)時氧化過程速率圖。其中體系中的氫氣的實(shí)時監(jiān)測是使用了unisense公司的氫氣微電極測試完成的，圖b表示的是細(xì)胞膜中氫化酶的活性監(jiān)測。圖c表示的是細(xì)胞需氧呼吸過程中對氫氣的依賴，其中對于氫氣濃度的實(shí)時監(jiān)測主要是基于未進(jìn)行任何處理的細(xì)胞和經(jīng)過尼日尼亞菌素處理的細(xì)胞。圖d表示的是基于未進(jìn)行任何處理的細(xì)胞和經(jīng)過尼日尼亞菌素處理的細(xì)胞的氫氣的氧化速率。圖e表示的是分批的全細(xì)胞培養(yǎng)過程中的二氧化碳的固定。

圖3、嗜酸的甲烷氧化菌株（sp.RTK17.1）在氫氣存在條件下進(jìn)行批培養(yǎng)下混養(yǎng)生長和自養(yǎng)生長情況。圖a表示的是甲烷氧化菌在混合營養(yǎng)條件下和自養(yǎng)條件下的生長期情況。圖b表示的是混合營養(yǎng)生長條件下的甲烷氧化速率，以及使用了顆粒甲烷單加酶抑制劑乙炔處理后的混合營養(yǎng)生長條件下的甲烷氧化速率。圖c表示的氫氣的氧化速率變化情況。圖d表示的是嗜酸的甲烷氧化菌株在有氫氣條件存在以及無氫氣環(huán)境下的生長情況對比。

圖4、嗜酸的甲烷氧化菌株（sp.RTK17.1）對于甲烷和氫氣的既定氧化。其中細(xì)胞是使用靜態(tài)間歇式生物反應(yīng)器在50攝氏度下反應(yīng)培養(yǎng)的，其中固定相培養(yǎng)環(huán)境頂部空間使用的是氮?dú)庵谐淙氩煌瑵舛鹊亩趸肌錃?、甲烷等氣體。其中圖a表示的是氮?dú)庵谐淙肓?9%CO2,20%O2,、9%H2，體系中的甲烷、氫氣、氧氣的隨時間的變化情況。。圖b表示氮?dú)庵谐淙?%H2、9%CH4體系中的甲烷、氫氣、氧氣的隨時間的變化情況。圖c表示的是甲烷存在或氫氣存在的條件下，加入10%的氮?dú)夂螅w系中的甲烷、氫氣、氧氣的隨時間的變化情況。

圖5、嗜酸的甲烷氧化菌株（sp.RTK17.1）的甲烷和氫氣的氧化模型示意圖。從圖中可以看出該菌在進(jìn)行混合營養(yǎng)生長時，氫氣和甲烷的氧化都生產(chǎn)出同等當(dāng)量的還原產(chǎn)物對苯二酚（QH2），其中的大量的氫質(zhì)子轉(zhuǎn)移動力是基于氫質(zhì)子改變?yōu)镕1F0-ATP和酶產(chǎn)生的的足夠量的ATP能量。對苯二酚則是通過氫氣氧化提供的電子用于甲烷單甲氧化酶的催化產(chǎn)生的。NADH的還原則是基于甲酸脫氫酶以及氫氣依賴官能團(tuán)[NiFe]-氫化酶的作用通過卡爾文循環(huán)去固定二氧化碳實(shí)現(xiàn)的。

總結(jié)

本論文從地?zé)嵝退嵝酝寥乐邪l(fā)現(xiàn)了一株全新的甲烷氧化細(xì)菌Verrucomicrobia。這株細(xì)菌不同于已知的甲烷氧化菌，可以在高度酸性（pH2.0-2.5）的環(huán)境中生長，并且分類上與現(xiàn)有的甲烷利用細(xì)菌（Methanotroph）屬于不同的門。研究發(fā)現(xiàn)，該菌含有新型甲烷單加氧酶，利用一種獨(dú)特途徑同化甲烷，同時能夠利用氫作為有氧呼吸和碳固定過程中的電子供體進(jìn)行生長，該菌能夠能夠利用有機(jī)物或甲烷作為碳源生長，研究過程中使用了unisense的氫氣微電極和氧微電極正確的測試了進(jìn)行甲烷氧化細(xì)菌培養(yǎng)生長過程中的氫氣和氧氣的濃度分布情況，研究表面當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)器氧化亞氮和氧剖面濃度分布情況，從而了解到這類甲烷氧化菌的生長機(jī)制，首次提出了甲烷氧化菌能夠通過對氫的氧化獲取生長的能源，該機(jī)理的提出也拓寬了今后甲烷氧化細(xì)菌生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的研究。