背景介紹：研究表明細胞在培養(yǎng)和組織中也可能對更為溫和缺氧環(huán)境作出反應(yīng)，通過復(fù)雜的基因調(diào)控反應(yīng)也包括選擇性激活，而這些基因大多數(shù)受到缺氧反應(yīng)因子的影響。在細胞培養(yǎng)實驗中控制細胞外圍的氧分壓通常是通過修復(fù)細胞培養(yǎng)上方的氣相介質(zhì)中的氧分壓，然而細胞外圍的氧分壓還取決于培養(yǎng)基是否攪拌，細胞的數(shù)量和他們的代謝率在一個特定培養(yǎng)環(huán)境中以及擴散介質(zhì)表面到瓶底的距離，本論文的的研究人員采用了一種新的檢測的手段（unisense）實現(xiàn)了對細胞周圍氧張力檢測，以及對個別細胞集落的局部效應(yīng)的氧分壓的監(jiān)測成為可能。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

應(yīng)用了克拉克型的Unisense氧氣微電極（尖端直徑為10um）測試了培養(yǎng)基環(huán)境中的細胞周圍的氧分壓，其中所研究的培養(yǎng)物放置在人工操作的顯微鏡上并置于培養(yǎng)箱內(nèi)。所有的測量都在培養(yǎng)箱內(nèi)進行，氧微電極以30度角度插入到培養(yǎng)基環(huán)境中對細胞周圍的氧分壓進行測試。

實驗結(jié)果

研究表明盡管暴露于環(huán)境空氣的氧分壓下，傳統(tǒng)的貼壁細胞在進行培養(yǎng)時可能會經(jīng)歷細胞周圍氧分壓低于維持充分氧化代謝所需的水平。當(dāng)細胞進行培養(yǎng)時，消耗氧的報告的更明顯，細胞培養(yǎng)是在氧分壓降低的情況下培養(yǎng)的(降低到4%左右的氧)。研究結(jié)果說明，如果不測量培養(yǎng)細胞周圍的氧分壓，是不可能的與體外培養(yǎng)結(jié)果聯(lián)系起來的(例如基因表達與氧分壓有關(guān)細胞所表達的)，而這一濃度可能會大大偏離記錄在氣相中的氧濃度。

圖1、在培養(yǎng)箱內(nèi)測量氧分壓的裝置顯示。氧微電極傳感器安裝在倒置的奧林巴斯CK41顯微鏡上，微電極使用了微操作控制臺進行控制。

圖2、研究了氧微電極傳感器在皮安表中對應(yīng)的線性響應(yīng)隨傳感器尖端周圍氧分壓的變化規(guī)律

圖3、常規(guī)培養(yǎng)的T-47D細胞對應(yīng)的氧分壓曲線(即氧分壓與瓶底以上高度距離的函數(shù)圖)。在第0天，每個燒瓶接種5×106或102個細胞，培養(yǎng)的細胞環(huán)境中為含5%二氧化碳的大氣。圖中的符號○□△◇分別代表的是1-、2-、3-和培養(yǎng)4天的培養(yǎng)基中的氧濃度剖面圖，每瓶對應(yīng)的是0.5×106個細胞，第0天接種時，所有這些剖面圖都表示的是測量的尖端直接落在菌落的頂部的測量值。然而，對于3天和4天的細胞培養(yǎng)物，獲得的數(shù)據(jù)是微電極的測量尖端與菌落之間的結(jié)束位置。如(b)所示,分別培養(yǎng)4天和7天，每個燒瓶接種106個細胞。

圖4、第7天培養(yǎng)T-47D細胞。每個燒瓶接種106個細胞，在含氧濃度為19%的體系中生長。

圖5、表面底部氧分壓差值對應(yīng)5×105細胞/培養(yǎng)皿接種時間的函數(shù)圖。第7天培養(yǎng)時，細胞周圍的氧分壓低于缺氧呼吸水平(1.3%)。開放的圓圈表示細胞在含4%氧氣的環(huán)境中生長，封閉的圓圈表示含19%氧氣的環(huán)境中生長。

總結(jié)

細胞正常培養(yǎng)的過程中，盡管可通過在氣相中環(huán)境中控制培養(yǎng)環(huán)境中高而恒定的氧氣濃度，但是細胞周圍的氧分壓的會隨著培養(yǎng)的進行會急劇的降低，因此每個細胞耗氧量由培養(yǎng)基中氧分壓曲線計算獲得的。研究人員發(fā)現(xiàn)某些哺乳動物細胞培養(yǎng)中生長時，氧分壓程度存在重要差異。氧在細胞培養(yǎng)基中的擴散速率較低，由于正常的呼吸作用，氧分壓的降低通常在細胞附近發(fā)生。因此為了標(biāo)準(zhǔn)化和優(yōu)化，監(jiān)測細胞周圍的氧分壓和細胞的耗氧量非常重要。

研究人員首次應(yīng)用了丹麥unisense公司集成的氧微電極系統(tǒng)，該套系統(tǒng)（unisense微剖面分析系統(tǒng)）使用的是克拉克型的微電極與皮安表結(jié)合使用，在顯微鏡的配合下可實現(xiàn)對細胞周圍的氧濃度分壓的在線監(jiān)測，由于使用的電極的尖端非常細（5um-500um之間，）可進入穿刺入到覆蓋細胞培養(yǎng)層處1.6毫米深的介質(zhì)層區(qū)域測試垂直橫斷面區(qū)域的氧濃度剖面，獲得相關(guān)的氧濃度剖面數(shù)據(jù)對于研究人員分析細胞培養(yǎng)過程中的耗氧提供了重要的數(shù)據(jù)支持，為研究人員在相應(yīng)的細胞或組織培養(yǎng)方案中提供重要的理論指導(dǎo)，這說明unisense這套剖面分析系統(tǒng)在細胞培養(yǎng)等領(lǐng)域存在很好的應(yīng)用前景。