為了簡(jiǎn)化穿透MEA的空間布置，在下文中，3D MEA將指包含多個(gè)突出微電極或穿透軸的MEA。因此，已經(jīng)使用微電子制造技術(shù)制造了用于連接神經(jīng)元組織的各種類型的3D MEA，其主要涉及在基底的頂部或底部表面上沉積或生長(zhǎng)電極材料（例如金屬、碳、陶瓷等）。近年來(lái)，MEA制造方法擴(kuò)展到還包括使用噴墨打印作為圖案化工具直接在聚二甲基硅氧烷(PDMS)、瓊脂糖和明膠基材上制造軟MEA，這也允許快速原型制作方法。此外，噴墨印刷已用于在平面MEA基板上制造3D微電極。通過(guò)打印納米粒子，開(kāi)發(fā)了軸高度、直徑和路徑任意變化的高密度3D MEA，并將其應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。此外，立體光刻3D打印已與金屬電極的油墨鑄造和電鍍相結(jié)合，用于在孔板中制造3D MEA。盡管如此，這些方法的印刷分辨率有限，低至數(shù)十微米，需要具有高楊氏模量的導(dǎo)電油墨，從而導(dǎo)致更高的橫截面足跡，并且缺乏或需要額外的步驟來(lái)實(shí)施用于鈍化印刷電極的絕緣層。

用于神經(jīng)元記錄的高度可定制的3D微電極的制造

我們?yōu)閮煞N互補(bǔ)的應(yīng)用模式開(kāi)發(fā)了高度可定制的3D MEA，以允許體外（圖1A）和體內(nèi)（圖1B）方法進(jìn)行神經(jīng)元記錄。對(duì)于體外方法，3D柱電極直接集成在芯片上，并保留平面MEA的傳統(tǒng)功能，例如易于硬件集成。該芯片是一種獨(dú)立設(shè)備，可用于球體、類器官和急性神經(jīng)切片的電生理記錄。相比之下，體內(nèi)方法的靈感來(lái)自植入式神經(jīng)探針的部署，其中3D MEA被插入神經(jīng)組織中。由于其靈活的設(shè)計(jì)，體內(nèi)方法也可用于針對(duì)3D神經(jīng)組織的體外應(yīng)用。

Fig1:3D MEA的應(yīng)用方式。A)體外設(shè)計(jì)通常將培養(yǎng)皿和3D MEA直接集成在芯片上，代表可用于球體、類器官和急性神經(jīng)切片的獨(dú)立設(shè)備。B)體內(nèi)設(shè)計(jì)將MEA與神經(jīng)元組織分離，其中MEA單獨(dú)制造在（柔性）基板上，并通過(guò)倒裝芯片粘合到印刷電路板上。連接到顯微操作器后，可以在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中降低探針以穿透神經(jīng)元組織。

3D MEA的制造僅包含三個(gè)主要步驟：

平面MEA的制造、3D空心聚合物柱的印刷以及導(dǎo)電材料的電化學(xué)沉積。

首先，通過(guò)傳統(tǒng)（或無(wú)掩模）光刻工藝制造剛性或柔性平面MEA（圖2Ai）。然后調(diào)整微電極的尺寸、間距和排列以適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)要求。對(duì)于剛性平面MEA，形成微電極、互連件和接觸墊的導(dǎo)電鈦/金/鈦(Ti/Au/Ti)層沉積在絕緣基板（二氧化硅或玻璃）上，并用SU-8覆蓋絕緣。對(duì)于柔性平面MEA，導(dǎo)電Ti/Au/Ti層嵌入兩個(gè)聚對(duì)二甲苯-C(PaC)層（每層5μm厚）之間。對(duì)于兩種MEA類型，頂部鈍化層和Ti層在接觸焊盤(pán)和微電極開(kāi)口處被蝕刻，從而暴露Au表面。在下一步（圖2Aii）中，使用2PP和生物相容性32-34光樹(shù)脂（例如IP-L）在剛性或柔性平面MEA的電極位置打印中空聚合物柱(Nanoscribe GmbH&Co KG，埃根施泰因-利奧波德港，德國(guó)）。為了增強(qiáng)基于2PP的結(jié)構(gòu)和平面MEA之間的粘附力，通過(guò)在空心柱的底部添加3μm厚的環(huán)形聚合物盤(pán)（也稱為基板）來(lái)擴(kuò)大接觸面積。然后將基板-柱元件的開(kāi)口與微電極對(duì)齊并打印在平面MEA的頂部，將兩者無(wú)縫打印為一個(gè)相干元件。因此，通過(guò)添加直徑為50–100μm的基板，或者在節(jié)距較窄的情況下，添加與打印區(qū)域窗口匹配的連續(xù)基板，支柱的接觸面積增加了30.5–124倍（參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分）。最后，同時(shí)作為模板和鈍化層的聚合物柱通過(guò)電化學(xué)沉積填充金（圖2Aiii），然后通過(guò)聚（3,4-乙撐二氧噻吩）的電聚合沉積電極涂層帽):聚苯乙烯磺酸鹽(PEDOT:PSS)。

Fig2:3D MEA的制造。A)通過(guò)打印3D聚合物模板(A ii)以及模板輔助電沉積Au和PEDOT:PSS在平面MEA基板(A)上制造3D電極。通過(guò)仔細(xì)控制電流，可以在柱的頂部形成帽(A iii)。B)模板輔助電化學(xué)沉積金在高度為35和65μm的直柱內(nèi)。在計(jì)時(shí)電流法過(guò)程中，使用-1.3 V的恒定電勢(shì)。電流-時(shí)間曲線展示了用Au填充不同高度的柱子的電化學(xué)沉積過(guò)程的四個(gè)階段，當(dāng)測(cè)量的電流開(kāi)始呈指數(shù)增加時(shí)停止，從而表明Au填充到達(dá)柱子的頂端。C)在第二個(gè)沉積步驟中，電流固定在-100 nA持續(xù)20 s(C)，以創(chuàng)建光滑且小的金帽(C ii)。以下PEDOT:PSS沉積通過(guò)循環(huán)伏安法進(jìn)行2-10個(gè)循環(huán)（在(C iii)中循環(huán)數(shù)為10），具體取決于PEDOT:PSS帽的所需尺寸(C iv）。D)聚焦離子束(FIB)-在底部切割一根單獨(dú)的柱子，顯示柱子的壁厚約為4μm(D)和頂端(D ii)。E)制造結(jié)果顯示了剛性3D MEA裝置(E)和具有不同高度(40–100μm)3D打印柱的陣列的放大圖片(E ii))。F)制造結(jié)果顯示靈活的3D MEA(F)和高度為500μm的3D打印柱的放大圖片(F ii)。

制造縱橫比高達(dá)33:1且電極直徑小至8μm的3D打印柱電極（表1；圖S1，支持信息），從而超越高達(dá)11的縱橫比：1和電極直徑小至10μm，如文獻(xiàn)中所述，使用2PP印刷工藝時(shí)30,31所提出的技術(shù)允許制造定制且可單獨(dú)尋址的中空聚合物柱（例如，電沉積過(guò)程中），因此提供了最大的靈活性，以滿足不同用例的要求。鑒于2PP提供的定制功能，任何所需的柱形狀僅受高縱橫比的限制，高縱橫比由柱模板的高度與外徑和柱間距之間的比率定義。因此，可以打印同一MEA上具有不同高度的柱（圖2Eii；圖S1B，支持信息），并且無(wú)需額外的努力即可實(shí)現(xiàn)多站點(diǎn)柱設(shè)計(jì)（圖S5，支持信息），以便從不同的神經(jīng)層記錄同時(shí)（參見(jiàn)第2.3節(jié)），因此可以在我們的MEA設(shè)備中實(shí)現(xiàn)微電極的3D空間排列。此外，正如FIB切割分析所示，由于柱底部的空心柱的壁厚為4μm而不是2μm（圖2Di），柱子表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性，正如理論上所預(yù)期的那樣。

最后，我們還探索了在不同基材上打印的可能性，發(fā)現(xiàn)在PaC等透明聚合物上打印是可行的。因此，我們能夠在剛性平面玻璃MEA頂部制造用于體外應(yīng)用的3D電極（圖2E），以及用于體內(nèi)應(yīng)用的柔性PaC基板（圖2F）。3D MEA的成功制造取決于五個(gè)主要加工特征：印刷界面的識(shí)別、未交聯(lián)2PP光樹(shù)脂的正確顯影、印刷品與平面MEA的對(duì)齊、2PP光樹(shù)脂和電沉積溶液的保質(zhì)期，以及執(zhí)行該過(guò)程的環(huán)境條件。

在2PP工藝中，找到基材-光樹(shù)脂界面非常重要，因?yàn)樗鼪Q定了打印的起始焦點(diǎn)。不正確的打印接口可能會(huì)影響打印的最終高度，例如，柱子變短，或?qū)е抡掣絾?wèn)題。此外，未開(kāi)發(fā)的柱子和印刷的未對(duì)準(zhǔn)是錯(cuò)誤的來(lái)源，可以防止金鹽溶液進(jìn)入柱子內(nèi)部并接觸平面MEA上的微電極。此外，2PP光樹(shù)脂的光學(xué)穩(wěn)定性（由保質(zhì)期決定）和穩(wěn)定的環(huán)境條件可能會(huì)導(dǎo)致打印參數(shù)發(fā)生變化，例如激光功率和掃描速度的調(diào)整。

Fig3:摘除嚙齒動(dòng)物視網(wǎng)膜的體外記錄。使用體外A)和體內(nèi)B)方法進(jìn)行視網(wǎng)膜記錄，顯示原始電信號(hào)(A-B)、尖峰活動(dòng)（帶通濾波信號(hào)）(A-B ii)和局部場(chǎng)電位（低通濾波信號(hào)）（A-B iii)在光學(xué)刺激下捕獲。A和B中各個(gè)光學(xué)響應(yīng)的快照表明，尖峰信號(hào)（黑色跡線）的放電速率（藍(lán)色跡線）在光刺激時(shí)增加（A-B iv）。在(A-B v)中顯示了不同的神經(jīng)波形。此外，在這兩種情況下，記錄了代表視網(wǎng)膜總活動(dòng)的四到五個(gè)刺激的平均ERG波形（藍(lán)色）。C)插入包含三個(gè)電極的多位點(diǎn)柱，每個(gè)電極的高度差為20μm。記錄顯示逐步插入后多部位柱的視網(wǎng)膜內(nèi)放置(Z 1–Z 4)。此外，還顯示了Z 4（C ii，紅色窗口）處的記錄提取物和單個(gè)多位點(diǎn)柱內(nèi)各個(gè)電極(C iii)捕獲的尖峰波形。

觀察到超大PEDOT:PSS電極涂層的機(jī)械不穩(wěn)定性（例如，十個(gè)CV循環(huán)后），在急性視網(wǎng)膜內(nèi)插入時(shí)，其會(huì)在與柱內(nèi)金線的界面處斷裂。盡管如此，通過(guò)減小導(dǎo)電聚合物帽的尺寸（例如，在兩個(gè)CV循環(huán)后），可以防止PEDOT:PSS電極涂層的碎裂，從而產(chǎn)生堅(jiān)固的涂層，在多次插入和超過(guò)10次的重新插入后顯示出機(jī)械和電化學(xué)穩(wěn)定性。使用（圖S8A，支持信息）。因此，多位點(diǎn)探針證明，即使是稍微過(guò)度生長(zhǎng)的帽，在插入超過(guò)10次時(shí)也是穩(wěn)定的。雖然多次插入后，一些3D微電極的阻抗增加，但大多數(shù)PEDOT:PSS帽仍然完好無(wú)損，并且約85%的電極保持了適合神經(jīng)記錄的電化學(xué)特性（圖S8B，支持信息）。盡管如此，如果在插入和縮回時(shí)對(duì)探頭不輕柔，則可能存在材料殘留的風(fēng)險(xiǎn)（圖S8B ii，支持信息）。無(wú)論如何，如果在制造過(guò)程中精確控制PEDOT:PSS帽的形成，這種風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)大大降低（圖S4，支持信息）。此外，鑒于其在生物組織中的多種用途，正如預(yù)期的那樣，在電極之間遇到了視網(wǎng)膜組織殘留物（圖S8A ii，支持信息）。因此，對(duì)于重復(fù)使用，必須進(jìn)一步研究清潔方案的實(shí)施情況。

結(jié)論與展望

在這項(xiàng)工作中，我們提出了一種新穎、簡(jiǎn)單、多功能且高度可定制的3D MEA制造工藝，可產(chǎn)生高縱橫比的3D微電極，用于研究復(fù)雜的3D神經(jīng)元系統(tǒng)。我們使用基于2PP的3D光刻工具將空心柱印刷到不同的平面MEA基板上，使用柱作為模板引導(dǎo)Au和PEDOT:PSS等導(dǎo)電材料的電化學(xué)沉積，從而使2D電極生長(zhǎng)成第三維度。與文獻(xiàn)30,31中報(bào)道的其他方法相比，我們的過(guò)程的新穎性依賴于使用空心柱而不是實(shí)心柱的想法。因此，在單個(gè)光刻步驟中產(chǎn)生的空心柱具有引導(dǎo)電化學(xué)沉積和鈍化導(dǎo)電材料的雙重目的。因此，將平面MEA基板修改為3D MEA的制造步驟被最小化，因?yàn)橹恍枰獌蓚€(gè)后處理步驟即可實(shí)現(xiàn)導(dǎo)電柱：印刷空心柱，用作后續(xù)電沉積的模板導(dǎo)電材料。

同樣，我們的方法在加工方面具有通用性和可重復(fù)性，因?yàn)榭梢栽趧傂裕ㄊ⑸系腟U-8）和柔性（PaC）MEA基板上以不同的設(shè)計(jì)制造3D MEA。因此，2PP印刷的可定制性以及在不同基材材料上實(shí)現(xiàn)印刷的可能性，以及在技術(shù)上使用不同的電沉積導(dǎo)電材料（例如Pt、PEDOT:PSS），使得該工藝能夠輕松適應(yīng)任何電極幾何形狀，并且具有具有可部署在任何平面MEA設(shè)備上的潛力。因此，制造3D微電極的電化學(xué)驅(qū)動(dòng)工藝也可以作為后處理步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如將3D刺激/記錄微電極與CMOS技術(shù)集成。在這種情況下，可以在平面芯片中使用CMOS兼容封裝和薄膜層（例如鈦和鎢）的使用，以阻止金屬接觸（例如Au或Pt）擴(kuò)散到硅中，從而使金屬接觸電極和通孔互連是可能的，57使得所提出的工藝與CMOS技術(shù)兼容。