摘要：植物在遭遇鹽堿、干旱、重金屬、低溫、酸、機械刺激等非生物脅迫時，細胞膜電化學(xué)特性的變化和調(diào)節(jié)往往是最早發(fā)生的植物細胞反應(yīng)之一，并與細胞內(nèi)的生理代謝活動之間存在復(fù)雜的聯(lián)系?；诖?，在過去的30年間，微電極離子流技術(shù)以其非損傷性、實時性、靈敏性和高分辨率等特有的技術(shù)優(yōu)勢，成為了研究逆境脅迫條件下植物的生理響應(yīng)及調(diào)節(jié)機制常用的技術(shù)手段。從跟蹤監(jiān)測界面反應(yīng)、解析基因功能、進行抗逆育種和研究信號物質(zhì)等方面綜述該技術(shù)在植物逆境脅迫生理研究中的應(yīng)用，旨在為研究植物功能基因組學(xué)和調(diào)節(jié)植物對環(huán)境的適應(yīng)性提供參考。

關(guān)鍵詞：微電極離子流技術(shù);逆境脅迫;離子流;活體;基因功能

中圖分類號：Q945.78;Q-3文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）01-0043-06

作者簡介：趙怡琳（1998—），女，江蘇常州人，碩士研究生，主要從事植物逆境生理研究。E-mail：1324822006 qq.com。

通信作者：汪曉麗，博士，副教授，主要從事植物營養(yǎng)電生理研究。E-mail：xlwang yzu.edu.cn。

非損傷微測技術(shù)（non-invasivemicro-testtechnique，NMT），別稱微電極離子流檢測（microelectrodeionfluxestimation，MIFE），最早由神經(jīng)科學(xué)家Jaffe于1974年提出原初概念[1]，如今開始廣泛應(yīng)用于動植物科學(xué)、微生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、醫(yī)學(xué)生理學(xué)、分子遺傳學(xué)等生物學(xué)領(lǐng)域，是近年來發(fā)展起來的可進行生理特征、生理功能動態(tài)測量的研究新手段[2]。在植物抗逆方面，NMT以其特有的優(yōu)勢被眾多研究者用于干旱、高溫、低溫、鹽漬、重金屬、病原菌等非生物脅迫和生物脅迫的研究中[2]。研究受逆境脅迫后植物組織或細胞表面附近的離子流變化，對于揭示植物在遭遇逆境時的物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運特征、生理響應(yīng)機制和調(diào)節(jié)機制都具有重要意義。

1、非損傷微測技術(shù)的原理和特點

當細胞或組織不論以主動還是被動方式吸收離子和分子時，樣品表面的離子或分子濃度會發(fā)生變化，與環(huán)境濃度形成濃度差，從而產(chǎn)生電化學(xué)勢梯度。非損傷微測技術(shù)通過離子/分子選擇性微電極技術(shù)，玻璃電極在臨近樣品表面的一段微小的距離內(nèi)來回移動，同時測量電化學(xué)勢梯度，通過Nernst方程得到該距離內(nèi)的離子或分子濃度差，并通過Fick第一擴散定律計算出流速，流速的正負符號反映了離子流或分子流移動的方向[3]。

NMT具有活體、實時、動態(tài)、直觀的優(yōu)點，并可以長時間多維度地進行離子/分子流測量與掃描[3]。該技術(shù)可用于各種生物組織或細胞的研究，可單獨或同時測量H+、Ca2+、K+、NH+4、Cd2+、NO-3、O2、H2O2等離子/分子，為生物學(xué)研究提供了良好的試驗系統(tǒng)平臺[4]。相比于傳統(tǒng)的微電極技術(shù)，其優(yōu)勢在于高靈敏度，兩者相差約6個數(shù)量級，而且在研究植物生理生態(tài)學(xué)過程中不須要破壞組織或細胞，能直接進行活體測定，可以實時反映進出植物體組織或細胞的離子/分子的動態(tài)變化規(guī)律。

2、非損傷技術(shù)在植物抗逆中的應(yīng)用

2.1、界面反應(yīng)

植物在遭遇逆境時會有一系列的生理生化反應(yīng)，從而表現(xiàn)出各種特有的響應(yīng)和調(diào)節(jié)機制。細胞膜透性和功能的改變是植物對逆境條件最為直接和快速的響應(yīng)[4]，進而才是在細胞器或細胞質(zhì)中進行的同化、代謝等生理過程。因此，從逆境條件下植物與外界環(huán)境之間的界面反應(yīng)著眼，探索界面上特征離子或關(guān)鍵離子的流動速度和方向變化，對研究植物的逆境生理具有極為重要的意義。研究者們已對鹽漬、干旱、重金屬的脅迫方面進行了廣泛的研究，所采用的生物材料、特征離子和測定部位等列于表1。

Sa等研究了楊樹在鹽脅迫下根表NO-3和H+的凈通量，非定植根表現(xiàn)出較強的凈NO-3外排，而真菌定植通過降低細胞膜表面pH值和抑制H+-ATP酶活性，阻止了NO-3的損失[5]。Tang等采用NMT研究了不同NaCl濃度下小果白刺（NitrariasibiricaPall.）根幼苗分生組織中Na+、K+和H+的流速，NaCl處理后，根系穩(wěn)定的K+流出量逐漸減小，并顯著增加了H+的流入[6]。Tang等研究了云杉根尖NH+4和NO-3的流速，在距離根尖13～15mm和8.0～10.5mm處檢測到NH+4和NO-3的最大凈流量，NH+4對云杉根尖吸收NO-3內(nèi)流表現(xiàn)出明顯的抑制作用[7]。Chen等采用NMT測定大麥根部K+和Na+的流速，發(fā)現(xiàn)具有耐鹽性的大麥H+泵活性較高，膜電位較低，使根細胞更容易將Na+從細胞質(zhì)泵入外培養(yǎng)基[8]。Huang等對三葉柑桔根系H2O2流速進行研究，發(fā)現(xiàn)菌根使主根和側(cè)根的H2O2外排量增加，從而減輕宿主植物干旱脅迫的氧化損傷[9]。Huang等使用NMT研究發(fā)現(xiàn)，湖北海棠（MalushupehensisRehd.）細根表面NO-3凈流入量下降，NH+4凈流入量明顯增加，說明NH+4在提高海棠耐旱性方面可能發(fā)揮著更重要的作用。在干旱脅迫下，2種銨轉(zhuǎn)運體（AMT4;2和AMT4;3）均顯著上調(diào)，而大多數(shù)與硝酸鹽吸收、還原和氮代謝相關(guān)的基因均下調(diào)。在正常氮水平下，5%聚乙二醇處理植株的生物量產(chǎn)量、根系生長和氮素吸收/減少值均高于低氮處理植株。這些結(jié)果表明，干旱脅迫對湖北海棠的不利影響可能隨著氮素的增加而減輕[10]。Zhang等的研究結(jié)果表明，利用聚乙二醇（PEG）模擬的干旱條件下，棉花NO-3通量由凈流入變?yōu)閮袅鞒?，在距根?.3cm處有1個明顯的峰值[11]。對照條件下，檉柳（Tamarixramosissima）距根尖0.3cm處未觀察到明顯的NO-3流入信號，而PEG處理顯著增強了檉柳距根尖0.3cm處NO-3的流入。Lv等首次制備了一種同時測定3種離子的氮化碳超靈敏微電極，用于測定水稻根表面不同位點Cu2+、Pb2+、Hg2+的流速[12]。Wu等研究了不同NO-3/NH+4比值對水稻根系吸收鎘（Cd）、木質(zhì)部轉(zhuǎn)位以及隨后Cd積累的生理和遺傳機制，結(jié)果表明，隨著NH+4-N比例的增加，根毛區(qū)凈Cd2+流量受到抑制[13]。此外，2種劑量Cd處理下，木質(zhì)部汁液中Cd濃度也呈現(xiàn)出隨NH+4-N比值增加而下降的趨勢。增加銨態(tài)氮營養(yǎng)有助于抑制水稻對Cd的吸收、木質(zhì)部運輸和隨后的積累。

2.2、解析基因功能

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，從植物的分子機制研究其抗逆機制也更為普遍。從分子學(xué)角度，植物抵御逆境是基因調(diào)控的結(jié)果。植物遭遇逆境時，通過啟動或關(guān)閉某些相關(guān)基因，改變生理代謝活動使植物適應(yīng)逆境[13]。通過基因工程，將可能具有抗性的基因組導(dǎo)入擬南芥等模式植物中，研究基因組對植物抗逆的作用和機制?；蚪M學(xué)方法可以全面研究抗逆基因的功能和表達調(diào)控，并且把模式植物的抗逆信息推廣到基因組復(fù)雜的農(nóng)作物上去[14]。同時可以克隆抗逆基因，在沒有抗性的植物中通過基因工程手段導(dǎo)入，改良作物的抗逆性[15]。

NMT在研究植物抗逆基因中的應(yīng)用見表2。Fan等將海馬齒（Sesuviumportulacastrum）的SpAHA1基因轉(zhuǎn)錄入擬南芥中，使用NMT測定質(zhì)膜中Na+、H+和K+的流速，結(jié)果顯示，SpAHA1蛋白在胞質(zhì)膜上具有H+-ATPase的功能，SpAHA1蛋白通過增加質(zhì)子的電化學(xué)梯度來降低Na+的積累，促進質(zhì)膜上Na+/H+反向運輸體的交換活性，在植物抵抗鹽堿逆境中起著十分重要的作用[16]。擬南芥CYSTM3在耐鹽脅迫方面起著負調(diào)控作用是Xu等運用NMT發(fā)現(xiàn)的，CYSTM3基因可以抑制擬南芥根系Na+外排，抑制一系列活性氧清除酶的活性[17]。Zhang等同樣研究了轉(zhuǎn)基因擬南芥，來自胡楊的PeJRL基因在NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因植株保留了K+，限制了Na+的積累[18]。PeJRL轉(zhuǎn)基因株系增加了Na+的外排量，這與編碼細胞膜SOS1、AHA1和AHA2基因的上調(diào)有關(guān)。PeJRL過表達植物中活化的H+-ATPases抑制了由NaCl誘導(dǎo)的去極化激活的K+通道介導(dǎo)的損失。此外，Cd2+借用Cu2+通道、Cu2+激活Ca2+通道等，均是Cd2+吸收增加的潛在機制。Zhang等的研究表明，MhMAPK4基因過表達降低了煙草根中Cd2+的凈流入量，轉(zhuǎn)基因煙草中Cd2+流入到穩(wěn)定狀態(tài)的恢復(fù)時間也比野生型煙草短，MhMAPK4過表達降低了煙草根細胞的死亡和凋亡，MhMAPK4通過調(diào)節(jié)根對Cd2+的吸收來調(diào)節(jié)Cd的積累，通過調(diào)節(jié)液泡加工酶（VPE）的活性來控制Cd引起的細胞死亡[19]。Ma等鑒定了粳稻抗寒性的數(shù)量性狀位點為COLD。過表達COLD1基因可顯著提高水稻的抗寒性，而缺乏或低表達COLD1基因的水稻對寒冷敏感。COLD1編碼定位于細胞膜，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的G蛋白信號調(diào)節(jié)因子。它與G蛋白相互作用，激活Ca2+通道感知低溫，加速G蛋白GTPase活性，使水稻具有抗寒性[20]。Zhou等使用NMT分析顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥根在冷沖擊下Ca2+內(nèi)流增加。在冷脅迫下，胞質(zhì)Ca2+作為信號分子的增加激活了下游COR基因的表達。因此，Ca2+的流入可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥COR基因表達增加[21]。

2.3、抗逆育種

傳統(tǒng)方法篩選具有抗性的植物品種較為耗時費力。非損傷微測技術(shù)的活體動態(tài)測量，使試驗周期縮短，能較為快速地進行選種育種。由于不同品種的植物在逆境下的生理生化反應(yīng)不同，所表現(xiàn)出的離子流特征也各有不同。將具有耐性的品種與沒有耐性的品種作對比試驗，了解其抗逆機制，總結(jié)具有耐性品種的離子流特征，建立抗性辨識模型。通過測定植物組織或器官具有特征性的一種或多種離子/分子流，來判斷該植物是否具有抗性，從而進行抗逆育種。

Liu等對馬鈴薯二倍體和六倍體根系K+、H+、Ca2+和Na+的凈通量進行研究，結(jié)果表明在鹽脅迫下，在根和葉組織中六倍體比二倍體保留更多的K+，積累更少的Na+。六倍體由于質(zhì)膜Ca2+通道對H2O2的高敏感性，有效地將Na+區(qū)隔在伸長和成熟根區(qū)[22]。Chen等為進一步了解大麥耐鹽性性狀的遺傳行為，在6個大麥品種間進行半雙列雜交，以已知耐鹽性品種為對照，研究在鹽脅迫條件下植物根系K+損失為基礎(chǔ)的耐鹽性配合力。耐鹽品種CM72和Numar表現(xiàn)出較高的一般配合力（GCA），有較高的耐鹽性（在鹽脅迫下K+損失量較?。23]。毛桂蓮等研究灌木葉片凈Na+、K+和Ca2+流速，發(fā)現(xiàn)在NaHCO3脅迫下，3種灌木通過不同的策略來消除Na+毒害。寧夏枸杞葉片通過將Na+外排來降低鈉毒害，而2種濱藜是將Na+區(qū)隔化，在葉表皮形成鹽腺[24]。Zhang等測定茶樹葉片K+流速，模擬干旱脅迫誘導(dǎo)的茶葉細胞中K+外排與12個茶樹品種的整體耐旱性呈較強的負相關(guān)。與此相一致的是，耐旱品種葉片K+的殘留量明顯高于敏感品種。外源施用K+顯著減輕了茶樹的干旱誘導(dǎo)癥狀，說明K+的保留是茶樹耐旱機制的重要組成部分。藥理試驗結(jié)果表明，耐干旱和敏感茶樹品種間，K+向外整流通道和非選擇性陽離子通道對PEG誘導(dǎo)的葉肉細胞K+外排的控制作用是不同的[25]。

2.4、信號物質(zhì)

植物感受脅迫信號，Ca2+在信號傳遞過程中發(fā)揮不可缺少的作用。Ca2+調(diào)節(jié)植物對環(huán)境脅迫的反應(yīng)，在脅迫條件下，胞內(nèi)Ca2+常常顯著增加，可以啟動相關(guān)基因激活一系列生化反應(yīng)，使植物能夠適應(yīng)環(huán)境脅迫[26]。Ca2+還能誘導(dǎo)相關(guān)蛋白合成，激活酶活性，參與活性氧的產(chǎn)生，使植物抗性增強[26]。使用非損傷微測技術(shù)檢測Ca2+流，能較為方便直觀地觀察到逆境下Ca2+流速和方向的變化，可以進一步研究Ca2+流對其他離子/分子流的影響，探究鈣信使在植物抗逆過程中起的作用。

Lang等通過研究甘草（Glycyrrhizauralensis）根部Na+和K+流速發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫會提高在調(diào)節(jié)K+/Na+平衡中起信號分子作用的Ca2+、H2O2、NO、胞外ATP水平，促進Na+的外流，抑制K+的損失[27]。Chao等研究了鈾脅迫下鬼臼菌根（Syngoniumpodophyllum）根部Ca2+流速，結(jié)果表明，黑曲霉能抑制根細胞的鈣外排，從而減弱了鈾對植物生長的毒害作用[28]。在干旱脅迫下，H2S介導(dǎo)離子通量誘導(dǎo)擬南芥氣孔關(guān)閉是Jin等通過測定擬南芥葉片H+、Ca2+、K+和Cl-流速發(fā)現(xiàn)的，此外還發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H2S在不影響H+流量的情況下，可誘導(dǎo)跨膜K+流出以及Ca2+、Cl-流入[29]。Rodrigo-Moreno等研究了銅脅迫下不同擬南芥根部的離子轉(zhuǎn)運情況，發(fā)現(xiàn)低濃度的Cu2+刺激根尖Ca2+內(nèi)流，但未刺激成熟區(qū)，銅誘導(dǎo)K+外排并且在銅暴露后，根尖的基礎(chǔ)過氧化積累有所減少。銅會在胞質(zhì)中產(chǎn)生羥自由基，從而調(diào)控細胞膜羥自由基敏感性的Ca2+和K+轉(zhuǎn)運系統(tǒng)[30]。

3、離子流與植物抗逆的聯(lián)系

在逆境中植物往往會受到滲透脅迫、離子失調(diào)、膜透性改變、生理代謝紊亂等危害，植物對逆境的生理方面的適應(yīng)變化包括改變生物膜透性、形成逆境蛋白、產(chǎn)生抗氧化防御系統(tǒng)、進行滲透調(diào)節(jié)等[31]，其中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)包括細胞與外界進行無機離子交換，如K+、Na+[31];細胞內(nèi)合成有機物質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿等[31]。因此在植物抗逆生理過程中進行滲透調(diào)節(jié)會伴隨著H+、Ca2+、K+、Cl-、Na+、H2O2等離子/分子流入或流出植物液泡或細胞。非損傷微測技術(shù)的試驗結(jié)果直接反映的是離子流速，從吸收或外排的離子動態(tài)變化角度可以體現(xiàn)植物細胞的滲透調(diào)節(jié)，表現(xiàn)出植物的抗逆能力。

植物抵抗鹽堿脅迫，可以通過細胞質(zhì)膜上的H+-ATP酶將H+泵到胞外，形成跨膜的H+濃度梯度從而驅(qū)動Na+/H+反向運輸體將細胞內(nèi)的Na+排出，同時也抑制了K+外流。Chen等對具有較強耐鹽堿脅迫能力的壇紫菜進行了研究，結(jié)果表明，與對照海草相比，壇紫菜具有較高的K+/Na+比值。壇紫菜通過Na+/H+反載體將Na+外排，同時降低了海鹽藻脫極化激活通道K+的損失，在鹽脅迫下維持Na+/H+的穩(wěn)態(tài)，使壇紫菜具有抗高鹽脅迫能力[32]。Ca2+在植物干旱脅迫中，是植物細胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)生理功能的信號物質(zhì)。郎濤等研究發(fā)現(xiàn)，胞外ATP、H2O2、Ca2+、NO等鹽脅迫信號是通過上調(diào)紅樹根系細胞質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運體系活性，在促進Na+和H+逆向跨膜轉(zhuǎn)運的同時，抑制K+外流[33]。

植物抵抗干旱脅迫主要通過細胞進行滲透調(diào)節(jié)來保持吸水能力[34]，在根尖細胞的無機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如K+、Cl-能保持滲透壓力和水分梯度，有利于細胞在干旱下維持水分。植物葉片的氣孔開閉也與K+密切相關(guān)，保衛(wèi)細胞中K+外排使水勢上升，氣孔關(guān)閉，減少植物蒸騰作用。Mak等研究發(fā)現(xiàn)，PEG誘導(dǎo)的短期離子通量響應(yīng)不同于植物在長期真實干旱條件下的離子通量，長期干旱導(dǎo)致H+流入量更小，K+和Ca2+的流出量更大[35]。聚乙二醇誘導(dǎo)的干旱和實際干旱條件在調(diào)節(jié)這些化學(xué)信號和膜傳輸系統(tǒng)方面可能是不同的。在PEG短期誘導(dǎo)的大豆基因表達和蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，沒有發(fā)現(xiàn)負責(zé)K+、H+和Ca2+通量的轉(zhuǎn)運體發(fā)生變化，說明短期脅迫時離子的流入流出是植物的應(yīng)激反應(yīng)。

植物對重金屬的排斥包括分泌化合物降低有效性、回避攝入、限制運輸和排出體外[36]，研究者們通過NMT研究植物對重金屬的吸收機制。Ma等研究發(fā)現(xiàn)，有硅培養(yǎng)的細胞與無硅培養(yǎng)的細胞相比，凈Cd2+內(nèi)流顯著減少[37]。因為細胞壁中64%的硅在細胞壁分離后與半纖維素成分結(jié)合，從而抑制了鎘的吸收。有硅培養(yǎng)的細胞壁表面電位的異質(zhì)性高于無硅培養(yǎng)的細胞壁表面電位的異質(zhì)性，且在添加鎘后均質(zhì)化。

4、問題與展望

由于全球氣候變化加劇，鹽堿化、干旱、洪澇、低溫、高溫等環(huán)境問題愈發(fā)嚴重，對植物的生存生長不利。多數(shù)植物通過調(diào)節(jié)自身生理機能對逆境有不同的抵抗機制，在生理調(diào)節(jié)過程中往往伴隨著H+、Ca2+、K+、Cl-、Na+、H2O2等離子/分子流入或流出植物體的過程，通過NMT進行離子/分子流的研究能夠從全新角度闡述植物的抗逆機制，獲得常規(guī)方法難以獲得的全新發(fā)現(xiàn)[4]。NMT直接在根、葉片細胞等活體植物樣品上，在不損傷細胞膜的情況下獲得離子/分子流速，不僅能夠研究植物抵抗逆境的生理生化反應(yīng)、微觀上基因調(diào)控的機制，還能夠通過對植物耐性機制的研究，篩選具備優(yōu)良性狀的生物品種。但非損傷微測技術(shù)在植物抗性研究方面也存在不足，多數(shù)植物都具有抵抗逆境的能力，所能獲得的植物材料有很多，檢測的離子或分子也多種多樣，不同的離子/分子流速在不同的植物材料中有不同的變化趨勢，但建立抗性辨識模型的比較少，沒有具體的評價指標。目前的研究大多僅是單方面采用NMT在植物某一生長時期進行離子或分子流速的測定，而研究植物的長期演化過程是動態(tài)連續(xù)的，各要素間存在復(fù)雜的互作關(guān)系，須要將NMT應(yīng)用于植物整個生命周期的不同發(fā)育階段的研究中[4]。

非損傷微測技術(shù)在理論研究和試驗實踐中，研究不斷深入，探測范圍不斷擴大，技術(shù)不斷完善，非損傷微測技術(shù)必將更準確、更全面地揭示植物體離子跨膜運動與植物生理功能之間的關(guān)系[2]。關(guān)于非損傷微測技術(shù)本身的改進，可以增加可檢測的離子/分子種類，探究植物體生命活動規(guī)律中不同離子/分子所起的作用，發(fā)現(xiàn)更多植物特定的離子/分子流速的變化趨勢，形成特征性圖譜。隨著可檢測的離子/分子種類增多，非損傷微測技術(shù)須加快技術(shù)革新，每次單一測定一種離子/分子已經(jīng)不能滿足要求，須要發(fā)展多通道離子檢測技術(shù)，更便捷地同時測定多種離子/分子，有效發(fā)揮實時、活體測定離子/分子的優(yōu)勢。對于該技術(shù)的應(yīng)用技巧方面，完整活體植株固定在操作平臺上測定時根系易晃動，使用濾紙和小瓷片壓住樣品根系;植物材料相同品種間根系活力差異較大，在準備樣品時選擇較為強盛的根系，并多做平行試驗;儀器反應(yīng)太靈敏，容易產(chǎn)生基線漂移，須在測定同種離子流不同品種時進行多次校準;試驗環(huán)境要求較高，由于樣品容易晃動，數(shù)據(jù)容易受環(huán)境影響而產(chǎn)生波動。還須進一步改進試驗條件。非損傷微測技術(shù)也應(yīng)與其他先進檢測技術(shù)結(jié)合研究，如熒光顯微、分子生物學(xué)、微域分析等，從不同層次不同角度全方位揭示植物的生理生化過程，逐步完善植物長期演化過程的應(yīng)用研究體系。拓展非損傷微測技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域需要豐富樣品的品種、類型以及不同的測試部位，如微管形成層、木質(zhì)部等。同時新的逆境條件出現(xiàn)在不斷出現(xiàn)，如納米物質(zhì)、病蟲害等，了解植物在新逆境條件下的適應(yīng)性與植物的生理生化機制，從而推廣非損傷微測技術(shù)在植物抗逆以及各領(lǐng)域研究中的應(yīng)用。

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