概括

人體微生物組包含多種微生物， 共享和競(jìng)爭(zhēng)相同的環(huán)境利基 [1, 2]。 人體內(nèi)主要的微生物生長形式是 生物膜狀態(tài)，其中緊密堆積的細(xì)菌、古菌和 真菌細(xì)胞必須合作和/或競(jìng)爭(zhēng)資源 為了生存[3-6]。 我們檢查了由腸道微生物組的主要真菌物種組成的混合生物膜， 白色念珠菌，以及五種常見的胃腸道細(xì)菌：脆弱擬桿菌、梭狀芽孢桿菌 產(chǎn)氣莢膜桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和 糞腸球菌 [7-10]。 我們觀察到生物膜 由白色念珠菌形成，提供低氧微環(huán)境 支持兩種厭氧菌的生長，甚至 當(dāng)在通常的環(huán)境有氧條件下培養(yǎng)時(shí) 對(duì)細(xì)菌有毒。 我們還發(fā)現(xiàn)，與生物膜中的細(xì)菌共培養(yǎng)會(huì)誘導(dǎo)生物膜中的大量基因表達(dá)變化。 白色念珠菌，包括 WOR1 的上調(diào)，其編碼 控制表型轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 C. albicans，從“白色”細(xì)胞類型到“不透明”細(xì)胞 類型。 最后，我們觀察到在懸浮培養(yǎng)中， 產(chǎn)氣莢膜梭菌誘導(dǎo)白色念珠菌聚集成 “微型生物膜”，允許產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞存活 在通常有毒的環(huán)境中。 這項(xiàng)工作表明細(xì)菌和白色念珠菌的相互作用以多種方式調(diào)節(jié)其環(huán)境的局部化學(xué)以創(chuàng)造生態(tài)位 有利于它們的生長和生存。

結(jié)果

真菌物種白色念珠菌形成混合生物膜 五種細(xì)菌

白色念珠菌，有或沒有產(chǎn)氣莢膜梭菌， 脆弱類桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌、 或肺炎克雷伯菌細(xì)胞，粘附在牛血清包被的聚苯乙烯孔上 90 分鐘，并允許 形成生物膜 24 小時(shí)，這是生產(chǎn)白色念珠菌生物膜的標(biāo)準(zhǔn)程序 [11, 12]。 共焦掃描激光 顯微鏡 (CSLM) 圖像證實(shí)，在所有情況下， 真菌和細(xì)菌物種并入生物膜（圖 1）。 細(xì)菌附著在白色念珠菌菌絲和 酵母形式的細(xì)胞（圖 1；圖 S1A-S1F 可在線獲取）。 而 B. fragilis 和 C. perfringens 對(duì) 生物膜結(jié)構(gòu)，大腸桿菌、糞腸球菌的摻入， 肺炎克雷伯菌降低了整體生物膜厚度（圖 S1G）。 我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)菌落形成單位 (cfu) 檢測(cè)作為 存在活細(xì)菌和白色念珠菌細(xì)胞的讀數(shù)和 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和白色念珠菌都被摻入 隨著時(shí)間的推移進(jìn)入生物膜（圖 2A-2D 和 S2A-S2C）。

圖 1. 白色念珠菌與五個(gè)形成生物膜 體外不同種類的細(xì)菌 （A-F）白色念珠菌在生物膜中生長 24 小時(shí) 單獨(dú)使用 (A) 或與大腸桿菌 (B)、肺炎克雷伯菌一起使用 (C)、糞腸球菌 (D)、產(chǎn)氣莢膜梭菌 (E) 或脆弱擬桿菌 （F）。 生物膜用伴刀豆球蛋白 A 染色， Alexa 594 和 Syto 13 染料，然后由 中海法會(huì)。 圖像是最大強(qiáng)度投影 的頂視圖和側(cè)視圖。 代表圖像 至少顯示三個(gè)重復(fù)。 比例尺 代表 50 毫米。 另請(qǐng)參見圖 S1。

C. perfringes 和 B. fragilis 在共培養(yǎng)中增殖 在環(huán)境含氧條件下具有白色念珠菌的生物膜

白色念珠菌和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌或脆弱芽孢桿菌細(xì)胞在生物膜中共培養(yǎng) 4、24、48 或 72 小時(shí)，在環(huán)境有氧或 缺氧條件。 每個(gè)物種隨時(shí)間的增長是 通過電鍍測(cè)量 cfu（圖 2A-2D）。 堅(jiān)持 并且白色念珠菌的生長不受存在或 沒有細(xì)菌細(xì)胞； 然而，最初的堅(jiān)持 C. perfringens 和 B. fragilis 在存在時(shí)增加了 10 倍 白色念珠菌。 在混合生物膜中，粘附后，產(chǎn)氣莢膜梭菌 顯示出大幅增長，從 w5 3 105 cfu/ml 到 w1 3 107 cfu/ml 在 24 小時(shí)內(nèi)，無論生物膜是在環(huán)境有氧還是缺氧條件下生長（圖 2A 和 2C）。 沒有白色念珠菌，存活的產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞減少 在環(huán)境含氧條件下 24 小時(shí)后低于檢測(cè)值 (<10 cfu/ml)（圖 2A）。 B. fragilis 表現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)（圖 2B 和 2D）。 除了標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室菌株 白色念珠菌 (SC5314)，我們測(cè)試了另外兩種臨床分離株 C. albicans 并發(fā)現(xiàn)他們也能夠支持 厭氧菌生長（圖 S2D 和 S2E）。 我們的數(shù)據(jù)證明 并入生長于下的白色念珠菌生物膜 環(huán)境好氧條件使厭氧菌生長 C. perfringens 和 B. fragilis； 沒有保護(hù)性生物膜， 這兩種細(xì)菌物種的生存能力迅速下降。

圖 2. 混合物種生物膜提供了一個(gè) 厭氧菌生長的利基 (A–D) 在生物培養(yǎng)基中生長的指定物種的 cfu/ml 單養(yǎng)或共養(yǎng)的薄膜在好氧或 缺氧條件。 細(xì)胞是從生物 僅薄膜（不是來自生物膜上方的介質(zhì)） 在 1.5、4、24、48 和 72 小時(shí)并鍍上 cfu。 (A) C. albicans 和/或 C. perfringes in oxic 狀況。 (B) C. albicans 和/或 B. fragilis in oxic 狀況。 (C) 缺氧條件下的白色念珠菌和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌 狀況。 (D) C. albicans 和/或 B. fragilis 在缺氧條件下。 (E) 在組成的生物膜中測(cè)量氧氣 使用 STOX 傳感器檢測(cè)指定物種。 從頂部每 10 毫米讀取一次讀數(shù) 到生物膜的底部。 對(duì)于所有圖形，至少兩次重復(fù)的平均值 顯示，誤差條顯示 SD。 也可以看看 圖 S2。

白色念珠菌生物膜創(chuàng)造缺氧微環(huán)境 檢驗(yàn)生物膜造成局部缺氧的假設(shè) 使厭氧菌生長的環(huán)境， 我們使用小型化的、 可切換的微量氧 (STOX) 傳感器，一種能夠 測(cè)量氧濃度低至 10 nM [13]。 使用 STOX 傳感器的測(cè)量結(jié)果顯示氧氣梯度 整個(gè)生物膜深度的濃度，降低 從靠近生物膜頂部的 w300 mM（環(huán)境氧）到 底部附近小于 50 mM（圖 2E）。 氧氣 無論是否生長白色念珠菌，梯度都保持不變 在單一栽培中或與產(chǎn)氣莢膜梭菌共培養(yǎng)或 B. 脆弱的。

生物膜與細(xì)菌共培養(yǎng)改變基因表達(dá) 在白色念珠菌中

確定白色念珠菌是否對(duì)細(xì)菌有反應(yīng) 在混合物種生物膜中，我們通過微陣列測(cè)量了白色念珠菌的基因表達(dá)變化（圖 3A；數(shù)據(jù)集 S1）。 相對(duì)于在不存在的情況下形成的白色念珠菌生物膜 細(xì)菌，許多基因被上調(diào)和下調(diào) 在細(xì)菌存在的情況下。 一些基因改變了表達(dá) 響應(yīng)所有的細(xì)菌種類，而其他的則是 特定于少數(shù)物種。

圖 3. 與生物膜中的細(xì)菌共培養(yǎng)誘導(dǎo)白色念珠菌中的差異基因表達(dá) (A) 白色念珠菌基因表達(dá)的熱圖 當(dāng)與指定物種共培養(yǎng)時(shí) 生物膜，與單獨(dú)的白色念珠菌相比。 顯示 是至少兩個(gè)生物學(xué)的中值 復(fù)制。 對(duì)照是指白色念珠菌，添加培養(yǎng)基以模擬細(xì)菌接種物， 與單獨(dú)的白色念珠菌相比。 沿顯示 x 軸是 2,863 個(gè)差異基因 在至少一種條件下調(diào)節(jié)至少 2 倍。 上調(diào)基因是黃色的； 下調(diào) 基因是藍(lán)色的。 (B) 編碼基因的基因表達(dá)模式 控制白色透明開關(guān)電路的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器。 頂部面板顯示 在不透明與 [14] 中的白細(xì)胞。 底部面板顯示 白色念珠菌共培養(yǎng)時(shí)的表達(dá)水平 在具有指定細(xì)菌種類的生物膜中， 與單獨(dú)的白色念珠菌相比。 另請(qǐng)參見圖 S3。

差異最大的基因是那些 編碼控制白色透明開關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。白色念珠菌，兩個(gè)細(xì)胞之間的過渡 類型，每種類型都可以遺傳多代 [15-18]（圖 3B）。 特別是 WOR1，它對(duì)“主”進(jìn)行編碼 白色不透明轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)器，被強(qiáng)烈上調(diào) 通過與肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和糞腸球菌共培養(yǎng)。 與肺炎克雷伯菌共培養(yǎng)也誘導(dǎo)了幾個(gè) 其他已知的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在 白色不透明開關(guān)，以獨(dú)立于 WOR1 的方式（圖 S3；數(shù)據(jù)集 S2）[14, 17, 19-21]。

盡管許多不透明特異性基因被上調(diào)，但完整的不透明特異性基因表達(dá)模式是 沒有觀察到，當(dāng)從這種情況中移除時(shí)， 白色念珠菌細(xì)胞恢復(fù)為“經(jīng)典”白細(xì)胞。 我們建議 與細(xì)菌細(xì)胞共培養(yǎng)使 C. albicans 轉(zhuǎn)變?yōu)?從白色到不透明，但需要額外的信號(hào) 用于完全切換。

C. 產(chǎn)氣莢膜受聚集保護(hù)并誘導(dǎo)聚集 懸浮培養(yǎng)中的白色念珠菌

進(jìn)一步探索白色念珠菌與 細(xì)菌微生物組成員，我們將它們?cè)趹腋∨囵B(yǎng)物中共培養(yǎng)，并觀察到一些細(xì)菌 誘導(dǎo)與白色念珠菌細(xì)胞的共聚集（表 S1；圖 4A-4D）。 最顯著的效果發(fā)生在產(chǎn)氣莢膜梭菌 在環(huán)境有氧條件下。 光學(xué)顯微鏡顯示， 產(chǎn)氣莢膜梭菌誘導(dǎo)的聚集體由 含有白色念珠菌和產(chǎn)氣莢膜念珠菌的致密團(tuán)塊 細(xì)胞和類似微型生物膜（圖 4G）。 通過監(jiān)測(cè)懸浮培養(yǎng)中生長的產(chǎn)氣莢膜梭菌的 cfu/ml 隨著時(shí)間的推移（圖 4H 和 4I），我們觀察到 白色念珠菌的數(shù)量使產(chǎn)氣莢膜梭菌在含氧懸浮液條件下存活至 w1 3 106 cfu/ml 的水平； 在沒有白色念珠菌的情況下，產(chǎn)氣莢膜念珠菌的 cfu 下降 至少五個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到檢測(cè)不到的水平 (<10 cfu/ml)，24 小時(shí) （圖 4H）。

圖 4. 產(chǎn)氣莢膜梭菌誘導(dǎo)聚集 環(huán)境含氧、懸浮期間的白色念珠菌 共培養(yǎng) 白色念珠菌懸浮培養(yǎng)物或 不含產(chǎn)氣莢膜梭菌，生長 4 小時(shí)或 24 小時(shí) 在 37 度，在缺氧或環(huán)境有氧條件下。 (A-F) 4 小時(shí)生長。 (A) 單獨(dú)的白色念珠菌，缺氧。 (B) 白色念珠菌 + 產(chǎn)氣莢膜念珠菌，缺氧。 (C) 單獨(dú)的白色念珠菌，好氧。 (D) 白色念珠菌 + 產(chǎn)氣莢膜梭菌，好氧。 (E) 白色念珠菌 + 無細(xì)胞上清液 C.產(chǎn)氣莢膜培養(yǎng)。 (F) 白色念珠菌 + 熱殺死的產(chǎn)氣莢膜念珠菌細(xì)胞。 (G) 白色念珠菌和/或產(chǎn)氣莢膜念珠菌的成像 光學(xué)顯微鏡。 代表性圖像是 顯示。 比例尺代表 20 毫米。 (H 和 I) cfu/ml 中生長的指定物種 單一培養(yǎng)或共培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng) 在環(huán)境有氧或缺氧條件下。 (H) 環(huán)境中的白色念珠菌和/或產(chǎn)氣莢膜念珠菌 好氧條件。 (I) 缺氧條件下的白色念珠菌和/或產(chǎn)氣莢膜梭菌 狀況。 顯示的是至少兩個(gè)的平均值 復(fù)制品； 誤差條顯示 SD。 (J–R) C. albicans 野生型或突變株 懸浮生長，在環(huán)境氧氣中，對(duì)于 4 小時(shí)與產(chǎn)氣莢膜梭菌。 (J) 重量級(jí)。 (K) rim101D/D。 (L) flo8DD/D。 (M) brg1D/D。 (N) tec1D/D。 (O) rob1D/D。 (P) bcr1D/D。 (Q) efg1D/D。 (R) ndt80D/D。 對(duì)每種條件或突變株至少進(jìn)行兩次測(cè)定。 另請(qǐng)參見圖 S4。

雖然微型生物膜太 小到直接探測(cè)氧氣濃度，我們注意到白色念珠菌 這些條件下的基因表達(dá) 基因顯著富集 在缺氧條件下調(diào)節(jié) (p = 1.4 3 1025 ) [22]（圖 S4A；數(shù)據(jù) 設(shè)置 S3)，表明微型生物膜與傳統(tǒng)的一樣， 表面粘附的生物膜，提供低氧環(huán)境。 與這個(gè)想法一致，我們發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞 還刺激常規(guī)早期階段的聚集 固體表面上的白色念珠菌生物膜形成（圖 S4B）。

我們用無細(xì)胞重復(fù)懸浮生長實(shí)驗(yàn) 上清液或熱滅活的產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞并觀察 兩者都能夠誘導(dǎo)白色念珠菌的聚集（圖 4E 和 4F）。 我們盲目篩選了205個(gè)缺失菌株的文庫 在白色念珠菌中 [23]（表 S2）并確定了八個(gè)轉(zhuǎn)錄 調(diào)節(jié)器編碼基因和觀察到的種間聚集所需的其他兩個(gè)基因（圖 4K- 4R 和 S4C）。 值得注意的是，六個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 （Brg1、Tec1、Rob1、Bcr1、Ndt80 和 Efg1）在我們的屏幕中找到 之前確定的常規(guī)監(jiān)管機(jī)構(gòu) 生物膜形成 [12]，提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，證明產(chǎn)氣莢膜梭菌通過生物膜遺傳程序誘導(dǎo)聚集體形成。 其他兩個(gè)缺乏聚集的調(diào)節(jié)突變體 是 rim101D/D 和 flo8D/D，尚未報(bào)告給 是常規(guī)生物膜形成所必需的。 DEF1，即 對(duì)菌絲擴(kuò)展很重要 [24] 和 ALS3，它編碼 一種對(duì)生物膜形成很重要并在與許多細(xì)菌物種相互作用中發(fā)揮作用的粘附素 [25-29]，也是 聚合所需（圖S4C）。 如補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)程序中所述，我們量化了聚合 使用沉降測(cè)定并驗(yàn)證刪除 菌株由基因“add-backs”補(bǔ)充（圖 S4D 和 S4E）。

這些結(jié)果支持一個(gè)模型，即在環(huán)境好氧條件下 懸浮培養(yǎng)，產(chǎn)氣莢膜梭菌誘導(dǎo)白色念珠菌 形成保護(hù)性聚集體，這取決于白色念珠菌 生物膜遺傳程序。 這些微型生物膜，其中含有 白色念珠菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，允許產(chǎn)氣莢膜梭菌 在通常有毒的含氧條件下存活。

厭氧細(xì)菌和白色念珠菌一起生物膜內(nèi)生長和在懸浮培養(yǎng)中誘導(dǎo)生物膜的形成——概括、結(jié)果

厭氧細(xì)菌和白色念珠菌一起生物膜內(nèi)生長和在懸浮培養(yǎng)中誘導(dǎo)生物膜的形成——討論

厭氧細(xì)菌和白色念珠菌一起生物膜內(nèi)生長和在懸浮培養(yǎng)中誘導(dǎo)生物膜的形成——實(shí)驗(yàn)步驟、致謝！