2結(jié)果

圖1為煙草葉片首先受到ST的激發(fā)，5 s過(guò)后，再受到1 s的紅光照射的ΔA515-550曲線，光強(qiáng)為1024μmol/m2·s。單周轉(zhuǎn)飽和光的激發(fā)使ΔA515-550信號(hào)迅速上升，然后以雙指數(shù)型在大約3 s內(nèi)衰減至0。通過(guò)曲線擬合，可以得到兩個(gè)指數(shù)加和形式的衰減方程為：

在單周轉(zhuǎn)飽和光激發(fā)的條件下，ΔA515-550信號(hào)的衰減呈現(xiàn)明顯的雙指數(shù)階段，擬合方程的第一個(gè)指數(shù)項(xiàng)的冪是1/0.839 97(底為e-1)要小于第二個(gè)指數(shù)項(xiàng)的冪1/0.687 25，因此ΔA515-550信號(hào)在第一階段以更快的速度衰減，在第二階段衰減的速度比第一階段要慢。

樣品首先用單周轉(zhuǎn)飽和光激發(fā)，5 s后，時(shí)長(zhǎng)為1 s的可見光開啟，ΔA515-550信號(hào)可達(dá)到的最大值是受到ST激發(fā)的P515信號(hào)最大值的大約5倍。

ΔA515-550曲線在1 s可見光照射下，呈現(xiàn)明顯的雙峰特征(圖2)。在可見光開啟后，第一個(gè)峰值迅速形成；第二個(gè)峰值在大約100 ms出現(xiàn)。雙峰之間產(chǎn)生了一個(gè)低谷。曲線最終在1 s內(nèi)衰減了大約30%。這種雙峰模式符合文獻(xiàn)中記錄的1 s可見光入射的測(cè)量曲線。

圖2煙草葉片受到1 s時(shí)長(zhǎng)可見光照射的ΔA515-550信號(hào)

圖3中顯示了光照60 s并在光源關(guān)閉后記錄之后的120 s煙草葉片的ΔA515-550信號(hào)，此信號(hào)特征與先前Schreiber等測(cè)量的信號(hào)以及Johnson等測(cè)量的信號(hào)完全符合。此信號(hào)的特征為：光源開啟后的ΔA515-550信號(hào)迅速達(dá)到峰值，隨后在接下來(lái)的30 s內(nèi)，信號(hào)衰減到峰值的50%左右。然后信號(hào)緩慢地提升至60 s左右達(dá)到穩(wěn)態(tài)。當(dāng)關(guān)閉光源時(shí)，ΔA515-550信號(hào)迅速下降至最低點(diǎn)，然后緩慢上升直至達(dá)到另一個(gè)穩(wěn)態(tài)。

圖3煙草葉片受到60 s時(shí)長(zhǎng)可見光及其之后關(guān)閉光源后120 s的ΔA515-550信號(hào)

3討論與結(jié)論

測(cè)量C3植物葉片的類囊體跨膜電勢(shì)可以采用微電極刺入的方法，但無(wú)論是電極直接刺入法還是改進(jìn)的膜片鉗技術(shù)，微電極法都要求葉綠體的尺寸足夠大，例如Vredenberg等在微電極法中所使用的銀道椒草(Peperomiametallica)或角苔類(Anthoceros)的葉綠體，再者，微電極刺入膜內(nèi)所產(chǎn)生的刺口處的電流流失對(duì)于跨膜電壓測(cè)量也會(huì)產(chǎn)生不可控的損失。因此，測(cè)量電勢(shì)引起的葉綠素分子的吸收峰遷移，即測(cè)量P515信號(hào)這樣一種無(wú)損樣本，靈敏迅捷的方法，現(xiàn)已成為實(shí)驗(yàn)室測(cè)量葉綠體跨膜電勢(shì)的一種常用技術(shù)手段。

在圖1中，葉片受到單周轉(zhuǎn)飽和光的激發(fā)時(shí)，P515信號(hào)的快速上升反映了在光反應(yīng)中心(PSI和PSII)發(fā)生的初級(jí)電荷分離反應(yīng)以及后續(xù)在細(xì)胞色素b6/f發(fā)生的次級(jí)電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)。隨后的電信號(hào)衰減則反映了質(zhì)子的跨膜傳導(dǎo)過(guò)程，較快的電信號(hào)衰減可能是ATP合成酶被激活而形成的質(zhì)子傳導(dǎo)所造成的，而較慢的衰減則可能是藉由類囊體膜中離子通道的質(zhì)子傳導(dǎo)所造成的。

在圖2中，P515信號(hào)的雙峰特征并不是必然會(huì)出現(xiàn)，特別是第二個(gè)峰會(huì)因?yàn)榇郎y(cè)量的樣本品種以及待測(cè)樣品的生理狀態(tài)不同而不同。Bulychev和Vredenberg通過(guò)同時(shí)測(cè)量樣品的葉綠素?zé)晒庖约翱缒る妱?shì)發(fā)現(xiàn)，跨膜電勢(shì)的第二個(gè)峰值在時(shí)間上與熒光曲線的一個(gè)瞬時(shí)下降相關(guān)聯(lián)，這可能是由下列光化學(xué)反應(yīng)所造成的葉綠素?zé)晒獯銣纾嘿|(zhì)體藍(lán)素(Pc)攜帶的電子傳遞至光化學(xué)反應(yīng)中心I(PSI)，并最終傳遞至鐵氧還蛋白-NADP+-氧化還原酶(FNR)的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。

在圖3中，關(guān)閉光源后，ΔA515-550信號(hào)急劇下降至最低點(diǎn)，隨后又緩慢地恢復(fù)上升到另一個(gè)穩(wěn)態(tài)，這個(gè)穩(wěn)態(tài)就被稱為所謂的“黑暗基線”，根據(jù)Kramer和Scaksteder首創(chuàng)的“DIRK”分析，即暗黑區(qū)間弛豫分析(Dark interval relaxation kinetics)法，黑暗基線至有光時(shí)的穩(wěn)態(tài)信號(hào)線的差值反映了在光照時(shí)跨膜的電勢(shì)差(ΔΨ)的大小，而黑暗基線至關(guān)閉光源時(shí)，P515信號(hào)下降的最小值點(diǎn)的差值反映了在光照時(shí)跨膜pH值的大小。因此，對(duì)暗黑適應(yīng)后的樣品進(jìn)行P515信號(hào)的測(cè)量，不僅可以得知關(guān)于跨膜電勢(shì)的信息，也可以獲知關(guān)于跨膜化學(xué)勢(shì)的數(shù)據(jù)，因此，最終也可定量地獲得跨膜質(zhì)子動(dòng)勢(shì)的大小。因此，P515光譜測(cè)定方法是一種可以測(cè)量跨膜電勢(shì)差、跨膜ΔpH以及跨膜質(zhì)子動(dòng)勢(shì)差的有力武器，可為深入研究C3作物光合過(guò)程原初反應(yīng)的能量轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制提供技術(shù)支持。

本研究以煙草葉片作為實(shí)驗(yàn)樣品，使用雙通道脈沖振幅可調(diào)式葉綠素?zé)晒鈨x(Dual-PAM-100)，并搭配最新設(shè)計(jì)的P515/535雙組件模塊，得出樣本在單周轉(zhuǎn)飽和光、1 s可見光及60 s可見光的P515光譜變化結(jié)果，并詳細(xì)分析其形成原因。結(jié)果顯示，P515光譜測(cè)定法是一種可以測(cè)量跨膜電勢(shì)差、跨膜ΔpH以及跨膜質(zhì)子動(dòng)勢(shì)差的靈敏迅捷、無(wú)損樣本的探測(cè)技術(shù)，可為今后農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的C3作物高光效品種的選育提供技術(shù)支持。