隨著人口老齡化、心血管疾病危險因素以及缺血性心臟病治療方法的增加，全球心力衰竭患者的數(shù)量已從1990年的3350萬增加到2017年的6430萬，幾乎翻了一番。盡管在藥物治療和臨床指導(dǎo)性治療心力衰竭患者方面都取得了重大進(jìn)展，但與心力衰竭相關(guān)的發(fā)病率和死亡率仍然居高不下。因此，心力衰竭的治療亟需治療新概念和新策略。硫化氫(H2S)是一種新型氣體信號分子，在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用，目前已有多種硫化氫供體正處于臨床實驗。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，H2S可直接通過S-巰基化目標(biāo)蛋白而發(fā)揮調(diào)控作用，巰基化修飾方式能快速、精確地調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳遞。盡管H2S與線粒體功能已有多篇文章報道，但在心力衰竭的發(fā)展過程中，H2S是否直接參與線粒體動力學(xué)調(diào)控及其分子機(jī)制仍未闡明。動力相關(guān)蛋白1(Drp1)能通過多種不同的方式被激活來驅(qū)動線粒體分裂。之前的研究發(fā)現(xiàn)，過量的脂質(zhì)攝取增加Drp1活性，導(dǎo)致線粒體過度分裂和心臟功能障礙(PMID:31896304)。然而，H2S是否直接靶向修飾調(diào)節(jié)Drp1活性進(jìn)而發(fā)揮心臟保護(hù)作用尚不清楚。近日，上海大學(xué)呼慶勛課題組在Redox Biology在線發(fā)表了題為“CystathionineγlyaseS-sulfhydrates Drp1 to ameliorate heart dysfunction”的研究論文，發(fā)現(xiàn)CSE/H2S通過巰基化Drp1的半胱氨酸607阻止Drp1過度活化、線粒體移位以及與VDAC1的相互作用，進(jìn)而緩解線粒體功能障礙和心肌細(xì)胞凋亡，表明靶向Drp1硫巰基化是一種潛在地改善心力衰竭的有效途徑。

Unisense微呼吸系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense微呼吸系統(tǒng)用來評估CSE/硫化氫通過巰基化Drp1改善心臟功能障礙效果。通過向微呼吸瓶中注入組織樣本，并添加L-半胱氨酸（底物）和磷酸吡哆醛，實時監(jiān)測H2S的產(chǎn)生。unisense微呼吸系統(tǒng)可以獲得在不同發(fā)育階段和不同組織中H2S產(chǎn)生的動態(tài)變化。通過添加Drp1，一種CSE抑制劑，能夠確定CSE對總H2S產(chǎn)生貢獻(xiàn)的比例。

首先，研究者發(fā)現(xiàn)小鼠CSE基因(心肌細(xì)胞中重要的H2S合成酶)的缺失(CSE KO)會對小鼠心功能紊亂的發(fā)生和心肌病理重塑產(chǎn)生影響，例如射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)顯著下降，左心室舒張內(nèi)徑和左心室舒張末期容積顯著增加等。相反，CSE過表達(dá)(CSE OE)可以改善異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的小鼠心力衰竭，這說明H2S在心功能調(diào)節(jié)中起著重要作用。

此外，隨著心力衰竭的進(jìn)展，CSE KO小鼠發(fā)生了更嚴(yán)重的心肌肥厚、心肌組織纖維化和細(xì)胞凋亡，而CSE OE則顯著降低了心衰引起的不利影響。這提示CSE/H2S通路介導(dǎo)了慢性β腎上腺素能受體激活過程中小鼠心功能紊亂的發(fā)生和心肌組織病理重塑。隨后，研究者探究了H2S對線粒體形態(tài)調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。研究者發(fā)現(xiàn)在CSE KO-ISO心臟中Drp1活性增強(qiáng)，而在CSE OE-ISO心臟中Drp1活性恢復(fù)，提示H2S抑制了Drp1的活性。Drp1從細(xì)胞質(zhì)到線粒體的轉(zhuǎn)移受多種信號和翻譯后修飾的調(diào)節(jié)，這其中Drp1的絲氨酸616(S616)磷酸化促進(jìn)其移位，而Drp1的絲氨酸637(S637)磷酸化則抑制其移位。實驗數(shù)據(jù)顯示，在CSE KO-ISO心臟中，S616處Drp1磷酸化水平較高，S637處Drp1磷酸化水平較低。然而，這些變化在CSE OE-ISO心臟中減弱。

此外，Drp1多聚體(Drp1活性的表現(xiàn)形式)也受到了H2S的調(diào)節(jié)。這些結(jié)果表明，H2S在心力衰竭時調(diào)節(jié)Drp1的磷酸化、移位、多聚體形成和GTPase活性。蛋白質(zhì)硫巰基化是一種新的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式。為了探討S-巰基化是否與調(diào)控Drp1活性有關(guān)，研究者比較各組Drp1的S-巰基化水平。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WT-ISO心臟和線粒體中Drp1的S-巰基化水平顯著降低，CSE KO進(jìn)一步下調(diào)了Drp1的S-巰基化水平，而CSE在整個心臟或線粒體部分過表達(dá)增強(qiáng)了Drp1的S-巰基化水平。此前有報道一氧化氮(NO)S-亞硝基化Drp1，促進(jìn)線粒體分裂，但S-亞硝基化與Drp1的S-巰基化之間的調(diào)節(jié)關(guān)系仍不清楚。為進(jìn)一步探索可能的潛在機(jī)制，研究者檢測了心臟中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白水平，發(fā)現(xiàn)WT-ISO和CSE KO-ISO心臟的iNOS蛋白水平顯著增加，然而CSE OE-ISO心臟的iNOS蛋白水平有所減少。這些數(shù)據(jù)提示，H2S參與iNOS途徑的調(diào)控。此外，增加H2S水平顯著減輕了Drp1蛋白的S-亞硝基化。在體外蛋白水平或者細(xì)胞中直接抑制iNOS活性，H2S仍能抑制Drp1的S-亞硝基化并促進(jìn)Drp1 S-巰基化。

這些結(jié)果表明，H2S直接與NO競爭性修飾Drp1。接著，研究者通過突變9個Drp1半胱氨酸明確S-巰基化的半胱氨酸殘基位點。H2S增強(qiáng)了WT Drp1以及除C607A外的大多數(shù)點突變的S-巰基化，表明C607是發(fā)生S-巰基化的殘基。C607在不同物種間的GED結(jié)構(gòu)域中高度保守并處于活性的關(guān)鍵位置，H2S可能通過調(diào)節(jié)Drp1的結(jié)構(gòu)構(gòu)象而激活Drp1活性。為了驗證這一假設(shè)，研究者檢測了在ISO刺激下Drp1磷酸化水平。在Drp1 WT和大多數(shù)Drp1突變體中Drp1磷酸化水平增強(qiáng)，而Drp1 C607A的突變顯著抑制了Drp1磷酸化。這些實驗表明，C607被特異性S-巰基化，是Drp1活化的關(guān)鍵殘基。為了進(jìn)一步證明S-巰基化Drp1的半胱氨酸607在調(diào)節(jié)Drp1活性和功能方面起著至關(guān)重要的作用，研究者構(gòu)建了Drp1 WT(Ad-Drp1 WT)和Drp1 C607A(Ad-Drp1 C607A)的腺病毒，并感染至成鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Drp1的表達(dá)和活性并未受到影響。

隨后，研究者檢測了Drp1 C607硫巰基化水平，發(fā)現(xiàn)NaHS處理的Ad-Drp1 C607A過表達(dá)的心肌細(xì)胞中幾乎未發(fā)現(xiàn)S-巰基化。在ISO處理的Ad-Drp1 WT過表達(dá)的心肌細(xì)胞中，Drp1的S616磷酸化和GTPase活性顯著增強(qiáng)。為了進(jìn)一步展示線粒體形態(tài)變化，研究者構(gòu)建了含有GFP-Drp1 WT(Ad-GFP-Drp1 WT)和GFP-Drp1 C607A(Ad-GFP-Drp1 C607A)的腺病毒。H2S能夠抑制ISO引起的成鼠心肌細(xì)胞線粒體過度分裂。但是，H2S孵育并沒有消除ISO誘導(dǎo)的Ad-GFP-Drp1 C607A過表達(dá)的心肌細(xì)胞的線粒體分裂。這些結(jié)果表明，Drp1 C607是心肌細(xì)胞中Drp1激活的關(guān)鍵位點。為了進(jìn)一步探索Drp1 C607在體內(nèi)的重要作用，研究者將Drp1及其突變體病毒原位注入心臟，并利用主動脈狹窄術(shù)構(gòu)建心力衰竭模型，發(fā)現(xiàn)Drp1 C607A過表達(dá)顯著降低了Drp1的S-巰基化和亞硝基化水平。同時，Drp1 C607A過表達(dá)加速線粒體分裂、減低心臟收縮功能、加重細(xì)胞凋亡，顯著抑制了H2S對心臟的保護(hù)作用。最后，研究者探究了S-巰基化Drp1下游分子機(jī)制。電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel1，

VDAC1)在細(xì)胞凋亡中起重要作用。研究者發(fā)現(xiàn)，ISO增強(qiáng)了心臟中Drp1與VDAC1的相互作用。CSE KO進(jìn)一步增強(qiáng)了Drp1與VDAC1的相互作用，而CSE OE抑制了這種作用，Drp1 C607A抵消了H2S作用，表明S-巰基化修飾調(diào)節(jié)Drp1與VDAC1的結(jié)合。H2S和VDAC1抑制劑(VBIT-4)均能阻斷Drp1 WT過表達(dá)的成鼠心肌細(xì)胞中ISO誘導(dǎo)的mPTP開放、ATP水平下降和細(xì)胞凋亡，但這些影響能被Drp1 C607A過表達(dá)所阻斷。

此外，線粒體NADH/NAD+比率是線粒體功能的關(guān)鍵指標(biāo)，研究者利用之前發(fā)明的遺傳編碼熒光探針mt-SoNar(PMID:34901920)，實時展示了線粒體NADH/NAD+比率的波動，更加直觀、精準(zhǔn)、原位呈現(xiàn)線粒體功能變化。綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)了一種新型的Drp1翻譯后修飾形式，該修飾在體內(nèi)外對異常線粒體分裂和心臟功能有保護(hù)作用。硫巰基化Drp1的半胱氨酸607調(diào)節(jié)Drp1磷酸化、GTPase活性以及與VDAC1的相互作用，從而改善線粒體功能和心肌細(xì)胞凋亡。

這些結(jié)果首次證實了Drp1的S-巰基化介導(dǎo)心臟線粒體功能。基于以上研究結(jié)果，通過靶向Drp1 S-巰基化并維持線粒體形態(tài)的干預(yù)措施可能是一種潛在地治療心力衰竭的新策略。上海市同濟(jì)醫(yī)院武丹副主任藥師為本論文的第一作者，上海市曙光醫(yī)院譚波副研究員和上海大學(xué)研究生孫媛媛做出了重要貢獻(xiàn)，上海大學(xué)呼慶勛副教授是通訊作者。該工作得到國家自然科學(xué)基金、上海市自然科學(xué)基金、上海市浦江人才計劃和上海市晨光計劃等科研項目資助。