2植物細胞pH值熒光顯微成像

與Ca2+相似，質子作為帶電離子必須嚴格控制在合適的濃度。H+參與信號轉導、而且直接影響植物發(fā)育。鑒于此，測量細胞pH是植物學家們的一個重要目標。傳統(tǒng)上講，人們一般用選擇性質子微電極等方法來對細胞pH進行測量。這些技術雖得到應用，但有很多不足，如分辨率低、時間響應滯后等。傳統(tǒng)的測細胞pH值的微電極方法，在實踐上仍有很多不足。由于pH在細胞內也是動態(tài)變化的，因此用熒光指示劑捕獲這一動態(tài)變化過程，是測定pH極佳的方法。

2.1質外體pH

質外體是植物細胞膜外區(qū)域，包括細胞壁、細胞間隙和木質部。這一區(qū)域的離子環(huán)境會影響物質的跨膜運輸，尤其直接影響根部的營養(yǎng)吸收和溶質傳輸。細胞壁的pH也調整其延展性與穩(wěn)定性、進而調節(jié)細胞形狀的大小。植物激素在質外體的運輸，也會受到質子化水平的影響。撇開細胞壁pH對植物眾多生理功能的影響不談，測定其數(shù)值仍然是確定質外體pH對生長發(fā)育調控的關鍵。有許多方法都是利用共聚焦顯微鏡來觀察熒光探針對質外體pH的標記。指示劑一般是用熒光粉或其衍生物來充當。熒光粉染料通常被用來作為雙重激發(fā)態(tài)比例指示劑，即一方面其一個激發(fā)態(tài)峰值的形成完全不依賴于細胞pH值、另一方面其第二個激發(fā)態(tài)峰值的形成完全依賴pH值。細胞pH值可根據(jù)二者激發(fā)態(tài)強度變化，按比例計算出來。目前細胞pH值的測定大體都按這種方式進行，代表著該技術的新方向。

2.2細胞質pH監(jiān)測

由于細胞溶質是強緩沖液、加之H+-ATP質子泵和多聚焦磷酸化的作用，植物細胞pH一般情況下維持在7.2左右。H+-ATP質子泵一般定位在細胞質膜和內膜上，其工作結果是去除胞質過多H+。最近有研究發(fā)現(xiàn)，細胞質pH值也受到了精巧的調節(jié)、以期響應外界刺激或植株生長。

當前，靈敏的熒光pH探針與高分辨率的空間圖像相偶聯(lián)，不僅使得人們可以使用熒光顯微鏡觀察亞細胞水平pH值的不均一性、而且可以觀察到不同細胞pH值的動態(tài)變化?；跓晒怙@微鏡使用的靈敏細胞質pH熒光染料一直是觀察和測定胞質pH的首選方法。目前，胞質pH熒光蛋白瞬時表達技術受到研究和使用者的歡迎，該技術還在發(fā)展之中。

3植物細胞ROS活體原位成像

3.1單線態(tài)氧細胞成像探針

3.2超氧陰離子細胞成像

圖2 4 d擬南芥根尖50-μM H2DCF-DA染色結果

(a)H2DCF-DA染色和加載的時間進程；(b)單個根尖細胞光漂白、染料吸收和泄漏，以及氧化還原勢的不同復合狀態(tài)；(c)根尖加載H2DCF-DA 10 min后,激光共聚焦顯微成像，然后再根據(jù)要求掃描目標區(qū)域活性氧；(d)總作用時間為26 s，掃描結束后，表皮外周細胞染色因光漂白逐漸變暗，而毗鄰的細胞因成像脅迫誘導產生ROS變亮。

3.3過氧化氫顯像探針

二氨基聯(lián)苯(3,3-Diaminobenzidine，DAB)是水溶性有機化合物，能與過氧化氫(H2O2)起反應，生成深褐色多聚物。與NBT使用方式相仿，DAB被用來進行植物生物脅迫或傷害脅迫條件下H2O2原位顯色。值得注意的是DAB對植物細胞有毒性，并且易于被光降解。熒光素衍生物2,7-二氯熒光黃(dihydrodichlorofluorescein diacetate，H2DCF-DA)目前被廣泛作為過氧化氫實時顯像熒光探針。由于與H2O2的高反應活性且可以直接通過細胞膜進入細胞，H2O2已被普遍用來監(jiān)測植物細胞H2O2的積累(圖2)。與其他ROS染料或傳感器相比，H2DCF-DA具有可視化程度高、加載進入細胞方便等優(yōu)點，但是該染料探針在完整細胞內不穩(wěn)定、易于發(fā)生光氧化或光猝滅作用。在應用中宜快、不宜慢。

4總結和展望

熒光探針為確定植物細胞Ca2+、pH和ROS的時空動態(tài)變化提供了一個強有力的工具和辦法。隨著人們對熒光探針與目標信號分子相互作用模式認識的深入，這些探針在對信號分子定量分析方面將起十分重要的作用。盡管本文討論僅限于Ca2+、pH和ROS探針，但是更廣泛的染料和修飾化GFP熒光蛋白感受器、已經被用來監(jiān)測G-蛋白活性、蔗糖濃度和酶活性等。熒光蛋白感受器的出現(xiàn)，使得顯微成像更為容易、尤其是用于轉化細胞、可以免除染料添加等定位試驗。期待著能有一個熒光蛋白數(shù)據(jù)庫資源，屆時亞細胞信號定位方面的試驗開展將更為便捷，也可以豐富人們對亞細胞信號動態(tài)變化的理解。目前，由于可以獲取多個熒光探針，因而可以同時測定多個細胞位點多個參數(shù)。這種多渠道獲取的熒光圖像，無疑對于我們確定亞細胞水平上標志性信號元件、有至關重要的作用。