細(xì)胞內(nèi)Ca2+，H+與活性氧(reactive oxygen species,ROS)是植物體內(nèi)廣泛存在的響應(yīng)生物或非生物脅迫、調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的因子。人們越來越傾向認(rèn)為，這些調(diào)節(jié)因子所顯示的時空動態(tài)復(fù)雜變化模式是它們信號行為的一部分。因此，檢測Ca2+，H+與ROS的動態(tài)變化，是研究和了解這些細(xì)胞因子對植物起調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵。然而，上述無機信號分子在細(xì)胞內(nèi)濃度等時空變化的有效檢測或監(jiān)測手段一直較少。目前這些信號的顯像技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)，并且可以在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上對上述信號(分子)進行原位實時定量鑒定。這些顯像或成像方法是基于一些小分子染料可以與Ca2+，H+和ROS發(fā)生專一性的相互作用、從而使染料熒光特性發(fā)生改變的原理。研究進一步發(fā)現(xiàn)，使用綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)，可以在亞細(xì)胞尺度上，對Ca2+，H+和ROS信號分子進行高分辨定位分析。

1 Ca2+在植物活細(xì)胞體內(nèi)的成像

1.1細(xì)胞內(nèi)Ca2+成像分子探針

Ca2+被認(rèn)為是廣泛存在的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)子，因此人們十分關(guān)注這種陽離子在細(xì)胞內(nèi)的時空變化水平，以期揭示出它是如何觸發(fā)細(xì)胞生理響應(yīng)的。細(xì)胞質(zhì)Ca2+水平常常呈現(xiàn)出諸如“尖峰形成”和細(xì)胞內(nèi)“鈣波”形式的變化、被認(rèn)為是細(xì)胞間觸發(fā)信息傳遞的方式。解碼Ca2+“指紋”的生物化學(xué)耦聯(lián)，使得Ca2+信號能夠參與細(xì)胞對多種環(huán)境刺激響應(yīng)的調(diào)節(jié)。Ca2+濃度過高時、它也是一種細(xì)胞毒素，在胞質(zhì)中其濃度為100 nM水平、而在細(xì)胞器內(nèi)或質(zhì)外體Ca2+濃度大致在在1 mM水平。在細(xì)胞質(zhì)中，一旦Ca2+濃度超出100μM水平時間過長，細(xì)胞功能將會因Ca2+沉積而遭到破壞。然而，Ca2+濃度在100μM水平上的增加，如果在時空上受到限制，細(xì)胞是可以耐受的。最典型的是植物根尖生長點和伸長區(qū)細(xì)胞。因此，對Ca2+濃度動態(tài)變化模式的監(jiān)測是研究Ca2+信號的關(guān)鍵。然而，Ca2+濃度瞬時變化的定位與成像卻面臨諸多挑戰(zhàn)。因為監(jiān)測細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度的系統(tǒng)必須足夠靈敏、而且能夠檢測到100μM濃度范圍Ca2+的變化、并且要避免其他二價離子如Mg2+的干擾。

廣泛用來進行植物細(xì)胞Ca2+顯像的染料，都含有一族碳酸殘基。這些染料通過碳酸殘基與Ca2+相互作用，使得其自身的熒光強度發(fā)生改變。例如，Ca2+熒光染料Green-1，Ca2+濃度從0到μM水平上的變化，可以使其熒光染料發(fā)光強度增加上百倍(圖1)?？梢越柚す夤簿劢够驘晒怙@微鏡，用肉眼觀察Ca2+染料熒光強度的增加，進而推斷Ca2+濃度水平的變化。一旦知道Ca2+探針的解離系數(shù)，可以用簡單的公式來確定Ca2+濃度變化：

Ca2+濃度=Kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)]

上式中Kd為Ca2+對Ca2+染料的解離系數(shù)；F是測定的熒光強度；Fmax是飽和熒光強度；Fmin是無Ca2+時的熒光強度。

在使用以上描述過的方法過程中，人們發(fā)現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescent resonance energy transfer，F(xiàn)RET)，這一基于Ca2+綠色熒光受體蛋白(green fluorescent proteins，GFPs)的轉(zhuǎn)基因新技術(shù)，對于信號檢測來說是很有吸引力的一項新技術(shù)。Palmer等分析研究了熒光共振能量轉(zhuǎn)移等成熟的技術(shù)方法，在實踐中有很強的應(yīng)用價值。

1.2向植物細(xì)胞內(nèi)加載Ca2+染料的方法

能與Ca2+相互作用的染料，均含有強烈的帶電基團、使得它們不易進入細(xì)胞。因此，要使Ca2+染料順利進入植物細(xì)胞，確實是個不小的挑戰(zhàn)。使細(xì)胞膜可逆性溶解或撕裂的技術(shù)，如電穿孔、去污劑增溶、微注射、膜片鉗、顆粒型傳送、或其它酸酯掩蓋電荷的方法，均可使染料順利進入植物細(xì)胞。值得一提的是，染料在胞質(zhì)和細(xì)胞器內(nèi)加載積累后、保持其完整性十分重要。因此，目前與葡聚糖相結(jié)合的染料分子、經(jīng)顯微注射加載進入細(xì)胞的方法受到廣泛重視。

圖1 Ca2+敏感的熒光染料和綠色熒光蛋白的特性

(a)Ca2+傳感染料Calcium Green-1，F(xiàn)ura-2和Indo-1熒光發(fā)射與激發(fā)波普。這些染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：(i)Ca2+結(jié)合后熒光強度增加的波長，(ii)Ca2+結(jié)合后熒光強度不同步增加的輻射波長，(iii)Ca2+結(jié)合后熒光強度下降的波長。(b)彩色表示波普的范圍。(c)Ca2+響應(yīng)的Ca2+傳感蛋白：鈣調(diào)素(calmodulin)結(jié)構(gòu)域在2個Ca2+結(jié)合的能量轉(zhuǎn)移伴侶蛋白CFP和YFP之間；鈣調(diào)素結(jié)合Ca2+后，蛋白構(gòu)象的改變使得CFP與YFP接近、FRET出現(xiàn)后導(dǎo)致激發(fā)態(tài)光產(chǎn)生。(d)Ca2傳感蛋白的熒光發(fā)射波普。Ca2+水平增加,CFP(FRET供體)輻射減弱,而YFP(FRET受體)輻射增加?？s略語：青色熒光蛋白CFP,cyan fluorescent protein；熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET,fluorescence resonance energy transfer；黃色熒光蛋白YFP,yellow fluorescent protein。