反硝化厭氧甲烷氧化（DAMO）過程可以在厭氧條件下同步實(shí)現(xiàn)脫氮和CH4減排。該過程是一種獨(dú)特的反硝化反應(yīng)，當(dāng)硝酸鹽或亞硝酸鹽作為電子受體被還原為N2的同時(shí)，CH4作為唯一電子供體被氧化為CO.研究表明，DAMO過程對(duì)海洋沉積物中CH4的消耗減排占據(jù)了主導(dǎo)地位，且在濕地、河流、深水湖泊等自然生境以及農(nóng)業(yè)土壤和廢水中均存在，該過程在全球碳氮循環(huán)的過程中起關(guān)鍵作用。DAMO微生物最早在淡水沉積物培養(yǎng)物中富集而得，起主導(dǎo)作用的功能微生物可以分為兩大類：NC10門細(xì)菌的Candidatus‘Methylomirabilis oxyfera’（M.oxyfera）和隸屬于ANME（anaerobic methanotrophic archaea,厭氧甲烷氧化古菌）中的一個(gè)簇ANME-2d的Candidatus‘Methanoperedens nitroreducens’（M.nitroreducens）。其中，DAMO古菌通常被認(rèn)為只能將硝酸鹽（NO3-）還原為亞硝酸鹽（NO2-），因此需要與其他微生物協(xié)同作用以達(dá)到理想的脫氮效果。目前的研究表明，DAMO古菌可以與DAMO細(xì)菌協(xié)同進(jìn)一步將NO2-還原為N2;同時(shí)，也已有研究發(fā)現(xiàn)在污水處理廠中DAMO微生物與厭氧氨氧化（Anammox）細(xì)菌共存現(xiàn)象，因此可以共培養(yǎng)DAMO古菌與Anammox細(xì)菌形成耦合系統(tǒng)，通過Anammox細(xì)菌進(jìn)一步利用DAMO古菌產(chǎn)生的NO2-作為電子受體?污水中的NH4+作為電子供體產(chǎn)生N2,從而實(shí)現(xiàn)總氮的高效去除和溫室氣體的減量排放。

將硝酸鹽型~DAMO與厭氧氨氧化聯(lián)合應(yīng)用，能夠在兩類優(yōu)勢(shì)菌種的協(xié)同作用下將各種形式的氮轉(zhuǎn)化為N2,同時(shí)實(shí)現(xiàn)總氮去除和CH4減排。然而，在對(duì)Anammox-DAMO耦合系統(tǒng)的研究過程中檢測(cè)到了N2O,這說明并不是所有的氮都能轉(zhuǎn)化為N2被去除，而是在脫氮過程中生成了N2O這一中間產(chǎn)物。迄今為止的研究結(jié)果沒有證據(jù)表明厭氧氨氧化細(xì)菌在正常代謝過程中會(huì)產(chǎn)生N2O1-1.N2O作為反硝化過程的中間產(chǎn)物，一般認(rèn)為在DAMO過程不會(huì)出現(xiàn)，這是因?yàn)镈AMO微生物的代謝途徑特殊，DAMO細(xì)菌利用NO歧化酶將NO轉(zhuǎn)化為N2和O2,產(chǎn)生的O2再對(duì)CH4進(jìn)行氧化，略過了中間體N2O的生成。雖然DAMO微生物中存在編碼N2O生成及降解的基因，但相關(guān)研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DAMO系統(tǒng)中有少量N2O的產(chǎn)生，然而降解N2O的基因卻未能表達(dá)。目前關(guān)于廢水處理過程中N2O產(chǎn)生的研究大多集中在傳統(tǒng)反硝化工藝，鮮少有人將研究聚焦于DAMO、Anammox等新型脫氮技術(shù)。

溫度變化會(huì)影響與N2O產(chǎn)消相關(guān)的微生物及酶的活性，從而引起N2O積累量的波動(dòng)。有研究者利用A/O SBR反應(yīng)器探究N2O隨溫度變化的產(chǎn)消情況，發(fā)現(xiàn)在15℃的低溫條件下N2O排放量比25℃時(shí)增加了1.9倍。Anammox與DAMO耦合脫氮過程中N代謝途徑較為復(fù)雜，不同溫度影響下該系統(tǒng)N2O的產(chǎn)消規(guī)律如何變化還有待探究。目前關(guān)于污水脫氮工藝中N2O排放的研究多集中在中低溫條件，然而在某些特定的氣候條件下高溫也會(huì)顯著影響廢水處理效果。本文以Anammox-DAMO系統(tǒng)為研究對(duì)象，探究中、高溫影響下該系統(tǒng)的性能與N2O產(chǎn)消變化規(guī)律，通過分子生物學(xué)手段及動(dòng)力學(xué)機(jī)制探明N2O產(chǎn)消的代謝途徑，并提出N2O減排策略。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)裝置

批次試驗(yàn)使用內(nèi)徑7.0cm、高14.0cm,有效容積為250mL的厭氧子反應(yīng)器（圖1）；連續(xù)試驗(yàn)使用內(nèi)徑16cm、高30cm、容積為3.5L的厭氧母反應(yīng)器。反應(yīng)器所有取樣口均設(shè)有閥門，閥門關(guān)閉時(shí)，反應(yīng)器呈全封閉狀態(tài)，維持反應(yīng)器內(nèi)厭氧狀態(tài)，整個(gè)反應(yīng)過程中使用磁力攪拌器進(jìn)行連續(xù)攪拌，保證反應(yīng)器內(nèi)泥水混合均勻。

圖1試驗(yàn)裝置

1.2接種污泥與營養(yǎng)液

試驗(yàn)系統(tǒng)為以Anammox菌和DAMO古菌為優(yōu)勢(shì)菌種的Anammox-DAMO系統(tǒng)，以西湖底泥?杭州西溪河底泥與農(nóng)田水稻土壤的混合污泥為接種物，在厭氧條件下供給CH4?NO3-和NH4+,試驗(yàn)期間系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定。

營養(yǎng)液新鮮配制，使用前氮吹30min以排除O2,組成如下：KH2PO40.05g/L;CaCl2·2H2O 0.3g/L;MgSO4·7H2O 0.2g/L;NaHCO31.05g/L;微量元素含量為1.25mL/L.微量元素包括（g/L）：15 EDTA,0.43 ZnSO4·7H2O,0.24 CoCl2·6H2O,0.99 MnCl2·4H2O,0.25 CuSO4,0.22（NH4）6MoO24·4H2O,0.19 NiCl2·6H2O,0.067 SeO4,0.014 H3BO3,0.05 Na2WO4·2H2O.營養(yǎng)液以去離子水為溶劑配制。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1批次試驗(yàn)為了研究溫度對(duì)系統(tǒng)的短期影響，并建立溫度影響下N2O產(chǎn)消動(dòng)力學(xué)模型，進(jìn)行為期10d的批次試驗(yàn)。從母反應(yīng)器中各取200mL泥水混合液注入?yún)捬踝臃磻?yīng)器中，各子反應(yīng)器的NO3-和NH4+起始濃度為20mg/L,CH4濃度為80mg/L,pH=7.0,試驗(yàn)溫度分別設(shè)置為20,25,30,35,40℃，每組設(shè)3個(gè)平行。試驗(yàn)期間，每24h取氣樣3.0mL,水樣3.0mL,經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后測(cè)定NO3--N?NO2--N及NH4+-N濃度，同時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中CH4含量以及N2O濃度變化。

1.3.2連續(xù)試驗(yàn)基于批次試驗(yàn)結(jié)果，篩選出反應(yīng)效率最優(yōu)以及N2O積累量最多的兩組具有代表性的溫度條件進(jìn)行連續(xù)試驗(yàn)，以揭示溫度對(duì)Anammox-DAMO系統(tǒng)的長(zhǎng)期影響。以DAMO微生物倍增周期25d為一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期進(jìn)行3個(gè)周期實(shí)驗(yàn)，保持各系統(tǒng)pH值為7.0——7.2.每48h取各反應(yīng)器水樣5.0mL,氣樣4.0mL,利用紫外分光光度計(jì)和氣相色譜儀分別測(cè)定NO3--N、NO2--N、NH4+-N、CH4、N2O的含量。以7d為一個(gè)加藥周期，每7d補(bǔ)充一次NO3-、NO2-、CH4.在試驗(yàn)前中后期分別取泥水混合物30mL,熱提法提取EPS提取液后測(cè)量含蛋白質(zhì)（PNs）和多糖（PSs）的胞外聚合物（EPSs）的組成以及濃度變化。在連續(xù)試驗(yàn)前、中、后期分別取5mL污泥樣品進(jìn)行高通量測(cè)序分析。

1.4分析方法

NO3--N、NO2--N和NH4+-N濃度使用雙束紫外~可見分光光度計(jì)（TU1901）按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量。使用氣相色譜儀（GC2030,島津）測(cè)量頂空N2O含量以及CH4含量。采用pH計(jì)（梅特勒FG2）監(jiān)測(cè)反應(yīng)器內(nèi)pH值的變化。采用熱提法分離EPS.PNs和PSs的測(cè)定方法分別為福林酚試劑法和蒽酮法。通過Usearch軟件和Gold數(shù)據(jù)庫將剩余序列聚集到操作分類單元（OTU）中。利用E.Z.N.A.®土壤DNA試劑盒（Omega Bio-tek,美國）進(jìn)行樣品DNA抽提進(jìn)行后續(xù)宏基因組測(cè)序。Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)用于宏基因組測(cè)序。

1.5動(dòng)力學(xué)模型

采用酶動(dòng)力學(xué)方程模擬NO3-、NH4+的還原以及N2O的產(chǎn)生和還原，如式（1）所示。

式中：RER為酶活性函數(shù)；Vmax,R為相應(yīng)還原酶反應(yīng)的最大比合成/活化速率，d-1;KE,i為酶誘導(dǎo)的半飽和常數(shù)，mg/L;KI,R為相應(yīng)還原酶抑制系數(shù)，mg/L;Ci為底物的水相濃度，mg/L;R為還原酶（即Nar、Nir、Nos）；i為相應(yīng)底物（即NO3-、NH4+、N2O）；CT為溫度變化因素。

2結(jié)果與討論

2.1溫度對(duì)Anammox-DAMO系統(tǒng)性能及N2O產(chǎn)消的影響

2.1.1溫度對(duì)Anammox-DAMO系統(tǒng)性能的影響根據(jù)厭氧氨氧化微生物和DAMO微生物的最適生長(zhǎng)溫度條件4-2,選擇20——40℃進(jìn)行短期試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。從圖2可見，NO3-、NH4+、CH4的降解速率均隨溫度的升高先增大后減小，而N2O的濃度峰值整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。系統(tǒng)在溫度為40℃時(shí)，N2O的濃度峰值達(dá)到最大。對(duì)溫度影響下的批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)40℃溫度條件對(duì)N2O排放量的影響最大，另外對(duì)各環(huán)境因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示30℃為該系統(tǒng)脫氮性能最優(yōu)的溫度條件，因此將30℃作為對(duì)照組，40℃作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行長(zhǎng)期試驗(yàn)研究，以探明不同溫度條件下Anammox-DAMO系統(tǒng)性能及N2O產(chǎn)消規(guī)律。

圖2短期試驗(yàn)溫度對(duì)Anammox-DAMO系統(tǒng)污染物降解及N2O峰值影響

圖3（a）和圖3（b）表明，Anammox-DAMO系統(tǒng)在40℃高溫條件下的脫氮性能要低于30℃，但隨著時(shí)間的推移，R2系統(tǒng)的脫氮性能較前期有提升，這說明該體系可以逐漸適應(yīng)高溫的脅迫，這主要?dú)w因于微生物會(huì)在極端環(huán)境下產(chǎn)生特殊的蛋白質(zhì)和酶來幫助細(xì)胞抵御脅迫。有研究表明，瞬時(shí)高溫沖擊會(huì)對(duì)Anammox菌的活性產(chǎn)生抑制作用，但長(zhǎng)期運(yùn)行下系統(tǒng)的性能逐漸恢復(fù)，這說明Anammox菌具有緩解高溫抑制的內(nèi)部機(jī)制。R2系統(tǒng)受到高溫的影響，在反應(yīng)過程中出現(xiàn)了亞硝酸鹽的積累，平均積累濃度為（1.43±0.47）mg/L.從圖3（c）可知，R2系統(tǒng)中的硝酸鹽、氨氮、CH4降解速率均低于R1系統(tǒng)，說明高溫對(duì)系統(tǒng)中微生物活性產(chǎn)生了抑制作用，影響了其正常代謝。有研究表明，Anammox活性（SAA）會(huì)隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，溫度對(duì)Anammox菌群蛋白質(zhì)變化情況的影響也說明了Anammox菌的活性在高溫下受到抑制。有研究探究了溫度對(duì)Anammox-DAMO共培養(yǎng)系統(tǒng)的影響，結(jié)果表明溫度對(duì)耦合系統(tǒng)的影響同樣呈先上升后下降的趨勢(shì)，在高溫下微生物活性降低8-3.

圖3長(zhǎng)期試驗(yàn)溫度對(duì)Anammox-DAMO系統(tǒng)中污染物降解影響

在兩個(gè)系統(tǒng)的長(zhǎng)期運(yùn)行過程中均檢測(cè)到了硝酸鹽異化還原為銨（DNRA）反應(yīng)，DNRA是一個(gè)特殊的生物反應(yīng)過程，使用亞硝酸鹽作為中間物將硝酸鹽還原成銨1-3.在R1系統(tǒng)中，硝酸鹽降解速率為0.08mmol/（L·d），氨氮降解速率為0.05mmol/（L·d），CH4降解速率為0.04mmol/（L·d），CH4降解速率與硝酸鹽降解速率實(shí)際比值（1:2.00）與DNRA反應(yīng)的理論比值（1:2.10）相符，說明在R1系統(tǒng)中同時(shí)存在DAMO、Anammmox、DNRA反應(yīng)。R2系統(tǒng)中硝酸鹽降解速率為0.06mmol/（L·d），氨氮降解速率為0.04mmol/（L·d），CH4降解速率為0.03mmol/（L·d），也觀察到了相同的結(jié)果，證明了DAMO、Anammmox、DNRA反應(yīng)的共存。

2.1.2溫度對(duì)Anammox-DAMO系統(tǒng)N2O產(chǎn)消的影響由圖4可知，2個(gè)系統(tǒng)均觀察到了明顯的N2O產(chǎn)消，且R2系統(tǒng)中N2O的總體累積量大于R1系統(tǒng)，其中R1系統(tǒng)N2O平均峰值濃度為（4.86±0.30）mg/L,R2系統(tǒng)為（6.85±0.59）mg/L.

相比于R1系統(tǒng)，R2系統(tǒng)產(chǎn)生了更多的N2O,研究表明，在N-DAMO系統(tǒng)中，nrfA的轉(zhuǎn)錄水平隨亞硝酸鹽濃度的增加而顯著上調(diào)，推測(cè)在R2系統(tǒng)中DAMO古菌為了應(yīng)對(duì)亞硝酸鹽的脅迫加劇了DNRA反應(yīng)的發(fā)生。在高濃度亞硝酸鹽影響下DNRA過程會(huì)生成NO,出于對(duì)NO的解毒作用，DNRA將NO轉(zhuǎn)化為N2O.Pereira在研究操作條件對(duì)厭氧氨氧化系統(tǒng)N2O產(chǎn)生的影響過程中發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽是N2O生成和積累的關(guān)鍵，這主要?dú)w因于AOB中由細(xì)胞色素P460（CytL）催化的厭氧羥胺（NH2OH）解毒途徑。Ding等也發(fā)現(xiàn)N2O釋放率與亞硝酸鹽濃度呈正相關(guān)，這是因?yàn)閬喯跛猁}和N2O會(huì)競(jìng)爭(zhēng)電子，當(dāng)用于亞硝酸鹽還原的電子通量高于用于N2O還原的電子通量時(shí)，N2O就會(huì)積累。同時(shí)，在亞硝酸鹽和硝酸鹽共存的情況下，亞硝酸鹽和硝酸鹽還原酶之間對(duì)電子供體的競(jìng)爭(zhēng)也可能導(dǎo)致N2O的不完全還原。另外，由于受到高溫影響，Anammmox細(xì)菌活性受到抑制，易造成中間產(chǎn)物NO的積累，為了防止NO對(duì)微生物造成毒害作用，Anammox細(xì)菌將NO轉(zhuǎn)化為N2O,因此在R2系統(tǒng)中產(chǎn)生更多的N2O。