目的是檢測運動前后大鼠血液及各組織H2S含量以及各個組織生成酶活性，分析運動后各組織H2S含量及其生成酶活性的變化特點。以雄性SD大鼠為實驗對象，采用敏感硫電極法檢測大鼠心臟，腎臟，肺，肝臟，骨骼肌，腦等組織H2S含量，對結(jié)果進行相關(guān)性分析。雄性SD大鼠16只，隨機分為2組：對照組、運動組。運動組大鼠做連續(xù)1小時的一次大強度性負重（10%體重）游泳運動，運動后即刻對大鼠取心臟，腎臟，肺，肝臟，腦組織、腓腸肌、腹主動脈血進行分析，采用敏感硫電極法測定各組織的H2S含量及其生成酶活性；對照組大鼠直接取樣測定。經(jīng)運動后與對照組相比除大鼠腦組織H2S含量明顯降低外，運動組大鼠各組織系統(tǒng)H2S含量較對照組有大幅度升高。經(jīng)運動后與對照組相比除大鼠腦組織H2S生成酶活性略有降低外，運動組大鼠各組織H2S生成酶活性較對照組均有不同程度的升高，尤以心臟、肺臟組織有大幅度升高。敏感硫電極法測量范圍廣，敏感性強，穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好，可應(yīng)用于大鼠腦、心臟、腎臟、肝臟、肺、骨骼肌H2S測定的研究，但在測試血漿H2S含量時精確度略顯不夠。經(jīng)一次性大強度運動后，與對照組相比大鼠心臟，肺臟，肝臟，腎臟，骨骼肌器官的H2S/生成酶體系均有不同程度的提升。運動使內(nèi)源性一氧化氮升高從而造成H2S/生成酶體系的升高。一次性大強度運動可增加各個組織無氧代謝酶活性，推測一次性大強度運動使機體無氧代謝酶活性的升高與H2S/生成酶系統(tǒng)活性的上升有著必然聯(lián)系。大鼠運動后腦組織H2S/生成酶系統(tǒng)活性降低的原因還不是十分清楚，推測測定時大鼠腦組織中的硫化氫生成酶胱硫醚—β—合酶(CBS)還未合成。大鼠血漿硫化氫濃度變化趨勢同大鼠其它組織，驗證了血管平滑肌CSE在大鼠運動后的表達同其它各組織。

據(jù)20世紀90年代以來的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性產(chǎn)生的H2S存在于哺乳動物的多種組織、器官,通過多種調(diào)節(jié)方式和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)形式發(fā)揮多種生理、病理作用，可松弛血管及消化道平滑肌，進而影響該組織的生理功能和病理過程;選擇性地增強N-甲基–D-天冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)的反應(yīng),并改變對海馬的長時程增強(LTP)作用的誘導(dǎo)(海馬的LTP是一個有關(guān)學(xué)習(xí)和記憶的突觸模型),從而影響大腦的發(fā)育;調(diào)節(jié)下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)釋放抑制由內(nèi)皮素誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞(VSMC)的增殖效應(yīng)進而調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞張力,可能起內(nèi)源性氣體信息分子的作用。由對其生理作用的研究,提出了H2S是一種新型的、具有類似氧化亞氮(NO)和一氧化碳(CO)某些特征的分子,如H2S是一種小分子量的氣體分子、不通過受體發(fā)揮作用、其生成受內(nèi)源性關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)、生理濃度時有很明確的特殊作用等,因此,將其歸為第3類內(nèi)源性氣體信息分子，從而開辟了對H2S認識、研究的新領(lǐng)域。

越來越多的資料表明，H2S廣泛參與機體多種生理和病理過程，可對機體心血管、神經(jīng)、代謝、消化、免疫、血液等系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)。目前檢測H2S及其生成酶的方法主要有兩種，即亞甲基藍比色法和敏感硫電極法。

亞甲基藍比色法是檢測H2S及其生成酶的經(jīng)典方法，為多數(shù)研究者所采用，但與新興的敏感硫電極法相比，其檢測敏感性較差。有關(guān)內(nèi)源性H2S和運動系統(tǒng)的研究尚未見報道，但有研究顯示，人體在運動時吸入一定濃度外源性H2S后，骨骼肌乳酸脫氫酶活性增加、有氧氧化酶活性呈不同濃度降低，猜測H2S作用于人體后通過抑制肌肉運動時有氧代謝，降低人體運動過程中的氧攝取，從而增加人體在運動過程中依賴無氧代謝的能力，提高機體的適應(yīng)能力。但其目前的研究也僅針對少數(shù)幾種哺乳動物、有限的幾種器官、系統(tǒng)。由于對H2S根深蒂固的毒性認識,限制了對其在生物體內(nèi)的生理作用、調(diào)節(jié)機制、病理生理等方面作用機制的進一步研究。雖然目前的研究范圍和領(lǐng)域在不斷地擴大,仍遠未達到對其本質(zhì)的認識,這就有待我們在今后的工作中不斷地進行探索。

本文通過設(shè)定運動刺激因素，檢測運動后大鼠心臟、腎臟、肺、肝臟各組織H2S含量及其生成酶活性，分析運動后各組織H2S含量及其生成酶活性的變化特點，并對H2S及其生成酶系統(tǒng)影響運動后各組織機能變化的可能機制進行初步探討，對大鼠運動前后各器官系統(tǒng)的硫化氫與生成酶含量進行比較以研究運動對其機體內(nèi)源性H2S含量的影響。

1材料與方法

1.1研究對象

健康雄性Spraque Dawley（SD）大鼠16只，體重175-208g,購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，國家標準嚙齒類動物飼料，合籠飼養(yǎng)，自由飲食，室溫20-25℃，相對濕度30-50%，保持12小時光照。

1.2研究方法

1.2.1實驗法

1.2.1.1實驗原理

實驗原理依據(jù)耿彬等研究結(jié)論：體液內(nèi)H2S主要以兩種形式存在，即物理溶解的H2S氣體（約占1/3）及化學(xué)形式存在的H2S（約占2/3），其化學(xué)特性呈弱酸性，在強酸條件下，HS-與H+結(jié)合生成H2S（公式1），從體液中揮發(fā)，但物理溶解部分不能析出，在強堿條件下，H2S和HS-與OH-結(jié)合形成比較穩(wěn)定的S2-（公式2，3），采用第三硫電極可以精確測量溶液中S2-的濃度，利用這一原理，我們采用第三硫電極，測定溶液中S2-，間接反映H2S的濃度。公式1：HS-+H+→H2S；公式2：2HS-+2OH-→S2-+2H2O；公式3：2H2S+2OH-→S2+2H2O。

1.2.1.2儀器與試劑

儀器：小型三用水浴箱（北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠1505型）。精密酸度計（上海理達儀器廠PHS-2C型），銀硫離子選擇性電極（上海雷磁儀表儀器有限公司pAgS-1型），硫化氫電極（丹麥Unisense公司），離心機（80-2離心沉淀器）。

試劑：5’-磷酸吡哆醛為Fluka產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2.1.3指標測試與方法

測試樣本的采集與處理：（1)大鼠稱重，實驗組行游泳力竭運動，力竭判斷標準:大鼠掙扎動作消失，沉入水下大于10S，撈出后平放無法完成翻正反射。（2)實驗組力竭后先行用2%戊巴比妥鈉按0.25ml/100g體重腹腔注射麻醉，腹主動脈取血后，速取左側(cè)腓腸肌、心臟（去除結(jié)締組織）；肝臟，腦組織，肺臟，腎臟，用錫紙包疊、標記后凍存待測。對照組直接進行步驟（2）處理。

稱取各個組織樣品，迅速剪碎后放入玻璃勻漿器中，以1:9（W/V）的比例加入勻漿液進行勻漿。勻漿液為50mmol/L磷酸鉀緩沖液（K2HPO4·3H2O，KH2PO4，pH6.8）。離心，取上清保存待測。

1.2.1.4組織硫化氫生成酶活性的測定

抗氧化液配制：氫氧化鈉（NaOH）8g，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）7g，去離子水85ml，抗壞血酸10g。要求現(xiàn)用現(xiàn)配。標準S2-溶液配制：硫化鈉（Na2S·9H2O）0.2402g，去離子水1ml，配制成1mol/L標準溶液，再加入等量抗氧化液。要求現(xiàn)用現(xiàn)配。

離子測定程序：①使用前，先將銀硫電極浸入去離子水中活化4h左右，再用抗氧化液活化90min左右；②打開酸度計電源，將測定項調(diào)至mV檔，預(yù)熱15min以上；③將敏感銀硫電極與參比電極一起浸入樣品中，待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄；④用去離子水沖洗電極；⑤每測一個樣品結(jié)束，電極必須浸入去離子水中以保持其活化狀態(tài)；⑥每次測定前均應(yīng)使用標準S2-溶液用抗氧化液稀釋成所需濃度做標準曲線。

（1）大鼠凍存組織0.2g,以1：9（質(zhì)量體積比）用預(yù)冷的50mmol/l磷酸鉀緩沖液（PH=6.8）1.8ml在手動勻漿器制備10%（W/V）組織勻漿。離心機離心，取上清液。（2）取組織勻漿液和反應(yīng)液加入反應(yīng)瓶：(總反應(yīng)體積的終濃度：100mmol/l磷酸鉀緩沖液（PH=7.4）、2mmol/l左旋半胱氨酸、2mmol/l磷酸吡哆醛)

總反應(yīng)體積2ml4ml5ml 10%組織勻漿液0.2ml0.4ml0.5ml 0.2 mmol/l左旋半胱氨酸0.02ml0.02ml0.05ml 0.05%磷酸吡哆醛1.78ml1.78ml4.45ml

（3）反應(yīng)瓶中小燒杯內(nèi)加入0.5ml 1mol/L NaOH，用雙層石蠟?zāi)ぱ杆俜饪冢唬?）應(yīng)瓶置于37℃水浴箱孵育90min；（5）揭開石蠟?zāi)?，加?.5ml 20%三氯乙酸，迅速封口，37℃水浴孵育60min終止反應(yīng)；（6）取出小燒杯內(nèi)液體用敏感硫電極法測定溶液中的H2S含量；（7）采用酸度計測定溶液中的電壓（mV）值；（8）利用標準曲線（使用標準S2-溶液用抗氧化液稀釋成40、80、100、1000、10000μmol/L溶液做標準曲線）計算S2-濃度，再計算H2S生成酶，結(jié)果以nmol/min·mg(protein)表示。

1.2.1.5組織硫化氫含量的測定

抗氧化液配制、標準S2-溶液配制、離子測定程序如前述。（1）取上述10%組織勻漿液0.5ml加入反應(yīng)瓶（100ml錐形瓶，其中放置一個5ml小燒杯）；（2）加入0.5ml 1mol/L HCl，使組織H2S釋放；（3）反應(yīng)瓶中小燒杯內(nèi)加入0.5ml 1mol/L NaOH，以吸收H2S，用雙層石蠟?zāi)ぱ杆俜饪?；?）將反應(yīng)瓶置于37℃水浴箱孵育4h；（5）取出小燒杯內(nèi)液體，加入0.5ml抗氧化液；（6）采用酸度計測定溶液中的電壓（mV）值；（7）利用標準曲線（使用標準S2-溶液用抗氧化液稀釋成1、10、20、40、80、100μmol/L溶液做標準曲線）計算S2-濃度。組織H2S含量以nmol/mg(protein)表示。

1.2.1.6血漿硫化氫濃度的測定

（1）取血漿1ml,加入等體積的抗氧化液；（2）采用離子計測定S2-含量；（3）具體操作：將敏感硫電極與參比電極一起浸入樣品中，待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄測定值，然后根據(jù)S2-溶液標準曲線計算硫化氫含量。H2S含量以nmol/mg(protein)表示。

1.2.2數(shù)理統(tǒng)計法：利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

運動前后大鼠腦組織硫化氫含量與生成酶活性變化（一）

運動前后大鼠腦組織硫化氫含量與生成酶活性變化（二）