背景介紹：組織工程技術(shù)的最新進(jìn)展使研究人員能夠開發(fā)厚層組織結(jié)構(gòu)，然后將其移植應(yīng)用到再生治療中去。然而目前臨床應(yīng)用上，至關(guān)重要的是所植入的工程化組織在使用前是安全和功能化的。但是目前對(duì)厚層組織構(gòu)建的實(shí)時(shí)質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究是有限的。本論文研究人員開發(fā)了一個(gè)關(guān)于工程組織活性進(jìn)行定量化的系統(tǒng)，用于實(shí)時(shí)評(píng)估組織的相關(guān)性能。研究人員在對(duì)工程組織活性的評(píng)估是通過(guò)測(cè)量沿垂直軸方向的氧濃度以及應(yīng)用光學(xué)相干斷層掃描（OCT）獲得工程組織的橫斷面圖像來(lái)判斷工程組織的厚度，并應(yīng)用氧微電極技術(shù)獲得的培養(yǎng)的組織細(xì)胞的氧濃度，獲取關(guān)于與工程組織性能相關(guān)的三個(gè)重要的參數(shù)，并得出了一種關(guān)于生物工程組織的活性可以通過(guò)測(cè)量組織內(nèi)部的氧梯度來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的方法。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

使用尖端直徑為10微米的克拉克型氧微電極結(jié)合三維操作器測(cè)試了培養(yǎng)皿中層狀細(xì)胞目標(biāo)區(qū)域中的氧濃度，氧微電極是先直接插入培養(yǎng)皿表面的層狀細(xì)胞層中直至微電極尖端恰好接觸到培養(yǎng)皿底部后，然后使用自動(dòng)三維操作器控制微電極向上移動(dòng)10um并等待10分鐘，然后沿垂直軸方向測(cè)試培養(yǎng)皿中的溶解氧分布，其中微電極的每次測(cè)試間隔距離為為40毫米，直到微電極尖端從培養(yǎng)皿表面的培養(yǎng)基中露出來(lái)為止。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本論文研究開發(fā)了一個(gè)關(guān)于工程組織活性進(jìn)行定量化的系統(tǒng)，從中實(shí)時(shí)評(píng)估工程組織的性能。工程組織活性的評(píng)估過(guò)程通過(guò)測(cè)量沿垂直軸方向的氧濃度以及應(yīng)用光學(xué)相干斷層掃描（OCT）獲得工程組織的橫斷面圖像來(lái)判斷工程組織的厚度。得到了工程組織上方的氧濃度，培養(yǎng)基質(zhì)中和工程組織上方區(qū)域的垂直軸上形成的氧梯度、組織內(nèi)部實(shí)時(shí)形成的氧梯度。其中組織內(nèi)部實(shí)時(shí)形成的氧梯度這個(gè)參數(shù)用于評(píng)價(jià)培養(yǎng)過(guò)程中工程組織的性能。這說(shuō)明生物工程組織的活性可以通過(guò)測(cè)量組織內(nèi)部的氧梯度來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。所提出的測(cè)量策略可應(yīng)用于開發(fā)更有效的組織培養(yǎng)方法，并支持了厚工程組織的培養(yǎng)提供了實(shí)時(shí)確認(rèn)定量的依據(jù)。

圖1、研究流程示意圖。圖(A)表示的是單個(gè)測(cè)試實(shí)驗(yàn)的時(shí)間安排表。圖(B)表示的是應(yīng)用氧微電極測(cè)試培養(yǎng)的層狀細(xì)胞氧濃度剖面的測(cè)試方法。(C)測(cè)試一定厚度的含層狀細(xì)胞的氧剖面濃度確定的定三種參數(shù):POC(樣品中細(xì)胞周圍的氧濃度)、gradOxmedium(樣品中培養(yǎng)基中的氧梯度)gradOxytissuess(樣品中細(xì)胞組織的氧梯度)。圖(D)表示的是光學(xué)相干斷層掃描（OCT）系統(tǒng)獲得的橫斷層面截流動(dòng)影像圖。

圖2、在正常培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞組織樣本在一次實(shí)驗(yàn)中獲得的一個(gè)示例實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集。并給出了在第0天(圖A所示)，第1天(圖B所示)和第5天(圖C所示)培養(yǎng)周期的三層的成肌細(xì)胞樣本測(cè)試數(shù)據(jù)。左邊的圖表示的是氧的剖面濃度分布。其中圖中顯示的氧氣濃度值的是與培養(yǎng)基與空氣界面處的氧濃度（Csat）的比值。一條垂直線表示的是層狀細(xì)胞和培養(yǎng)基之間的邊界。樣品組織的平均厚度就是顯示在這條線附近區(qū)域。圓括號(hào)中的數(shù)值表示層狀細(xì)胞內(nèi)的氧濃度與培養(yǎng)基與空氣界面處的氧濃度（Csat）的比值。右邊的圖顯示的是重組的組織樣本中心區(qū)域的3d圖像的側(cè)面和頂部視圖，應(yīng)用的是OCT系統(tǒng)獲得的橫斷層面影像圖。其中不同的空隙率值采用了不同的顏色表現(xiàn)出來(lái)。

圖3、在0-5天的培養(yǎng)過(guò)程中測(cè)量的細(xì)胞組織樣品厚度、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞周圍氧濃度（POCs）之間的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)。其中圖(A)在正常培養(yǎng)皿上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；圖(B)在細(xì)胞培養(yǎng)池進(jìn)行培養(yǎng)。其中圖中的第0天、第1天和第5天獲得的數(shù)據(jù)分別采用三角形、正方形及×形表示以便區(qū)分。

圖4、在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用細(xì)胞池培養(yǎng)的樣本獲得的數(shù)據(jù)。本論文中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)案例是在(A)第0天、(B)第1天和(C)第5天的三層成肌細(xì)胞樣本中獲得的數(shù)據(jù)。其中左邊左邊的圖表示的是氧的剖面濃度分布，右邊的圖表示的是采用了OCT系統(tǒng)獲得的橫斷層面影像圖。其中不同的空隙率值采用了不同的顏色表現(xiàn)出來(lái)。圓括號(hào)中的數(shù)值表示層狀細(xì)胞內(nèi)的氧濃度與培養(yǎng)基與空氣界面處的氧濃度（Csat）的比值。

圖5、提出用葡萄糖消耗率來(lái)評(píng)價(jià)層狀細(xì)胞的活力指數(shù)。其中圖(A-C)表示的是培養(yǎng)單、雙、三層的細(xì)胞組織所需的葡萄糖消耗速率。其中的細(xì)胞組織的培養(yǎng)是正常的培養(yǎng)皿(●)或細(xì)胞池(□)上培養(yǎng)。圖中的所獲得的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)是根據(jù)測(cè)量所用的時(shí)間間隔繪制的。圖(D-F)表示的△GCR指數(shù)定義為DGCRDay 4-5-GCR Day 0-1]/GCR Day0-1，其中的獲取的數(shù)據(jù)是分別從單層、雙層和三層細(xì)胞組織中獲得的，橫坐標(biāo)表的是在正常的培養(yǎng)皿中和在細(xì)胞池中進(jìn)行培養(yǎng)的方法。

結(jié)論與展望

為了恢復(fù)受損組織和器官的功能，研究人員首次提出關(guān)于將功能細(xì)胞移植到受損組織中的技術(shù)方案。移植細(xì)胞被認(rèn)為可以分泌細(xì)胞因子和趨化因子，從而誘導(dǎo)血管生成抗纖維化，抗凋亡，并將干細(xì)胞植入受損組織。隨著研究人員對(duì)厚組織的臨床應(yīng)用研究的不斷深入，厚組織的臨床應(yīng)用也越來(lái)越多重要，但是移植的厚結(jié)構(gòu)組織在使用前需要了解其是否安全有效，目前對(duì)于這一類的研究報(bào)道較少。本論文研究人員開發(fā)一種實(shí)時(shí)測(cè)量氧濃度的系統(tǒng)方法，研究人員在評(píng)價(jià)組織的性能時(shí)采用了unisense公司生產(chǎn)的克拉克型氧氣微電極，該微電極可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于組織細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中關(guān)于細(xì)胞組織上方的氧濃度、培養(yǎng)基質(zhì)中和工程細(xì)胞組織上方區(qū)域的垂直軸上形成的氧梯度以及細(xì)胞組織內(nèi)部實(shí)時(shí)形成的氧梯度測(cè)試。獲取的這三個(gè)重要的氧濃度參數(shù)對(duì)于判斷工程細(xì)胞組織的活性及組織的功能化的非常重要，這也意味著生物工程組織的活性是可以通過(guò)測(cè)量組織內(nèi)部的氧梯度來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)完成的。這種測(cè)量策略的提出為今后的在厚工程組織的培養(yǎng)提供了實(shí)時(shí)確認(rèn)定量的方法。這也另一個(gè)側(cè)面說(shuō)明了丹麥Unisense公司開發(fā)的克拉克型氧微電極在移植細(xì)胞培養(yǎng)工程學(xué)領(lǐng)域方面存在非常好的應(yīng)用前景。