用于刺激視網(wǎng)膜神經(jīng)元的電子視網(wǎng)膜假體有望恢復(fù)視力。然而，傳統(tǒng)視網(wǎng)膜植入物的剛性電極會對軟視網(wǎng)膜組織造成損害。由于它們與退行性視網(wǎng)膜中的靶細(xì)胞的接近程度較差，因此它們的選擇性也有限。

近日，延世大學(xué)材料科學(xué)與工程系的Jang-Ung Park教授，眼科的Suk Ho Byeon教授以及釜山國立大學(xué)有機(jī)材料科學(xué)與工程系的Seung Geol Lee教授報道了一種柔性人造視網(wǎng)膜，具有直接打印的3D LM微電極，能夠進(jìn)行微創(chuàng)視網(wǎng)膜刺激。體內(nèi)實(shí)驗表明，可見光照明誘導(dǎo)了光線入射的局部視網(wǎng)膜區(qū)域的RGCs的尖峰活動，表明活rd1小鼠具有視力恢復(fù)的潛力。這些結(jié)果對不均勻視網(wǎng)膜變性患者的個性化人工視網(wǎng)膜的開發(fā)具有預(yù)后意義。其主要研究方向為以電化學(xué)為基礎(chǔ)的柔性可穿戴仿生器件的制備及應(yīng)用。

相關(guān)工作以“Liquid-metal-based three-dimensional microelectrode arrays integrated with implantable ultrathin retinal prosthesis for vision restoration”為題發(fā)表在Nature Nanotechnology上。

基本內(nèi)容

視網(wǎng)膜變形疾病通常會造成感光細(xì)胞逐漸喪失或者永久性損傷，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的視力損害。然而，視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元能夠得以保留，該組織的電激活能夠產(chǎn)生視覺感知（光幻視），這使得制備利用光響應(yīng)裝置電刺激內(nèi)層視網(wǎng)膜神經(jīng)元的電子視網(wǎng)膜假體成為一種有前景的恢復(fù)視力的方法。值得注意的是，人類受試者及相關(guān)手術(shù)表明視網(wǎng)膜和植入物之間的不一致（例如電極與細(xì)胞之間的距離，細(xì)胞與設(shè)備之間的機(jī)械適配）是限制該設(shè)備成效和應(yīng)用的主要原因。為了解決這一限制，人們研究了超薄柔性光電器件以將其共形地附著在彎曲的視網(wǎng)膜表面上，但扁平形狀的電極會導(dǎo)致局部凹凸不平的視網(wǎng)膜表面產(chǎn)生幾何間隙。三維（3D）微電極有望有效刺激神經(jīng)系統(tǒng)，縮短電極與細(xì)胞之間的距離。此外，它們可以通過繞過不應(yīng)被刺激的神經(jīng)元來刺激選擇性局部區(qū)域，從而提供出色的選擇性和高空間分辨率。但是，先前報道的3D神經(jīng)電極往往利用剛性固態(tài)材料，這可能或直接損害柔軟的視網(wǎng)膜或?qū)е乱暰W(wǎng)膜內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，該研究團(tuán)隊公布了一種軟人造視網(wǎng)膜，將柔性、超薄和光敏晶體管陣列與液態(tài)金屬（LMs）的軟3D刺激電極集成在一起，用于視力恢復(fù)。其中，低毒性軟共晶鎵銦合金（EGaln）液態(tài)金屬被3D打印為具有高分辨率的刺激電極，相對于以前使用的剛性柱狀/尖峰電極材料相比，最大限度地減少了視網(wǎng)膜的不良損傷。此外，局部涂覆在這些EGaln-LM電極尖端上的鉑（Pt）納米團(tuán)簇能夠有效地將電荷注入視網(wǎng)膜神經(jīng)元。機(jī)器學(xué)習(xí)應(yīng)用于動物實(shí)驗期間產(chǎn)生的輸出信號，以分析誘發(fā)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)（RGC）棘波。并在體內(nèi)實(shí)驗證實(shí)了可見光照射引起的信號放大在光入射局部區(qū)域的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中引起實(shí)時反應(yīng)，能夠使患有大量感光細(xì)胞變性的活視網(wǎng)膜變性（rd1）小鼠恢復(fù)視力，有望應(yīng)用于治療人類視網(wǎng)膜變性相關(guān)疾病并促進(jìn)視力修復(fù)。

圖1.采用3D LM微電極陣列的軟人工視網(wǎng)膜。

首先，作者介紹了3DLM微電極陣列軟人工視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和體內(nèi)外生物相容性。該微電極（圖1a）能夠緊鄰不均勻變性視網(wǎng)膜表面，LMs突出的柔軟柱狀探針直接刺激視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）。從該器件結(jié)構(gòu)的布局來看（圖1b），EGaln微柱陣列通過3D打印直接印刷在光電晶體管的漏電極表面上，柱子側(cè)壁被聚對二甲苯C層封裝，頂端電鍍了鉑納米團(tuán)簇（鉑黑PtB）增加了微電極的納米級粗糙度和它們的電化學(xué)表面積。光電晶體管用于產(chǎn)生光電流，增大漏極電流，并在漏極電壓的脈沖刺激下，通過微電極注入RGCs的電荷顯著增加，然后在RGCs內(nèi)誘發(fā)的動作電位傳遞到視神經(jīng)，從而替代視覺信息。這種人造視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)將高分辨率晶體管陣列和3D LM微電極集成在一起，每個微電極尖端均具有PtB涂層，且這些涂層沒有改變EGlan本身的彈性模量（圖1c-1e）。為了確保該裝置的體內(nèi)/體外生物相容性，作者使用人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的活/死細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞生存能力的測試以及在植入活體rd1小鼠五周后相關(guān)免疫和神經(jīng)毒性的測試，結(jié)果表明該裝置滿足醫(yī)療器械的體外/體內(nèi)毒性標(biāo)準(zhǔn)（圖1f-1g）。

圖2.光電晶體管陣列的光電特性和三維LM微電極的電化學(xué)特性。

然后，作者表征了該軟性人工視網(wǎng)膜的光電及電化學(xué)特性。不同光強(qiáng)度照射下該設(shè)備顯示出典型的光敏場效應(yīng)晶體管行為（圖2a-2b），并且具有較快的光響應(yīng)和恢復(fù)時間（圖2c）。此外，該晶體管陣列與入射光強(qiáng)度呈現(xiàn)線性比例（圖2d）并且允許在光照期間觀察通過鷹形蔭罩圖案的光（圖2e）。為了得到一個柱狀3D LM微電極陣列作為刺激電極，作者使用具有高分辨率打印的3D直接打印系統(tǒng)（圖2f）。其中玻璃毛細(xì)管嘴的內(nèi)徑?jīng)Q定了EGaln柱的直徑，載物臺的縱向下降速度決定支柱的高度（圖2g-2i）。此外，循環(huán)伏安曲線表明了該器件的阻抗和電荷存儲容量不隨支柱的高度而顯著變化（圖2j-2k）。

圖3.使用WT和rd1小鼠視網(wǎng)膜的離體實(shí)驗。

隨后，作者使用野生型（WT）和rd1小鼠的視網(wǎng)膜探究了該器件的體外電生理作用，包括光、電刺激和電極的影響。先是記錄了它們的視網(wǎng)膜在3D LM微電極上通過視覺或者電誘發(fā)時的反應(yīng)，每個記錄電極與每個刺激電極相鄰放置（圖3a-3b）。將來自WT和rd1小鼠的分離的視網(wǎng)膜放置在該設(shè)備上，3D LM微電極朝向視網(wǎng)膜的RGC側(cè)。通過在沒有設(shè)備操作的光照下記錄了它們的視覺誘發(fā)電位（VEPs），而電誘發(fā)電位（EEPs）在黑暗狀態(tài)下利用設(shè)備操作時進(jìn)行記錄。此外，由于小鼠是只有兩種視錐細(xì)胞類型的兩色哺乳動物（對藍(lán)光和綠光敏感），因此視覺誘發(fā)使用470 nm的藍(lán)光。結(jié)果顯示光線沒有在rd1小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)引起視網(wǎng)膜反應(yīng)（圖3c）。而在電誘發(fā)實(shí)驗中，兩種小鼠的視網(wǎng)膜均出現(xiàn)可比EEP量級的RGC尖峰，而且rd1小鼠比WT型放電活動更早、增強(qiáng)更明顯（圖3d）。已知rd1小鼠視網(wǎng)膜的形態(tài)學(xué)變化，包括RGC大小和內(nèi)核層厚度的減少，會影響RGCs的功能特性，導(dǎo)致刺激閾值增加和潛伏期延長。接著作者分別使用平面型電極和具有不同高度的3D LM微電極在不同強(qiáng)度的光照下對兩種視網(wǎng)膜進(jìn)行設(shè)備操作時誘發(fā)EEP（圖3e-3i），結(jié)果顯示在平面型電極上誘發(fā)的RGC荊波放電率和光強(qiáng)度成比例增加（圖3g）。與rd1情況相比，由于正常感光層的天然反應(yīng)，WT小鼠視網(wǎng)膜顯示出更高的放電率。而盡管柱狀微電極具有與高度無關(guān)的電化學(xué)特征，但柱狀結(jié)構(gòu)電極在電刺激過程中增加了RGCs的放電活動（圖3j）。且當(dāng)高度超過90μm時射速再次下降。這可能是由于刺激尖端穿過目標(biāo)RGCs時誤將RGCs作為目標(biāo)造成的。

圖4.用無監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)的信號分類。

考慮到視網(wǎng)膜活動的復(fù)雜性，作者利用無監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)進(jìn)行信號處理。根據(jù)信號的大小和形狀，給定的數(shù)據(jù)被分為不同的組（圖4a）。然后，進(jìn)行了K-均值聚類，將初步分類的信號作為輸入數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示視網(wǎng)膜尖峰數(shù)據(jù)被進(jìn)一步分類為具有不同潛在價值大小的四個聚類（圖4b）。通過無監(jiān)督的機(jī)器學(xué)習(xí)來分析這些分類的視網(wǎng)膜尖峰，以獲得具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均信號。此外，聚類1、2和3的同一聚類內(nèi)的信號顯示了相似的潛在值形式和時間持續(xù)時間（圖4c-e)。當(dāng)刺激RGC體細(xì)胞時，典型的細(xì)胞外記錄的尖峰反應(yīng)顯示膜電位迅速降低（去極化），隨后增加（復(fù)極），而RGC軸突顯示相反的尖峰反應(yīng)。3D LM微電極電刺激后立即記錄的分類RGC信號波形僅呈現(xiàn)亞毫秒去極化的軀體RGC反應(yīng)。這些結(jié)果表明了使用3D LM微電極選擇性刺激RGC體細(xì)胞的潛力。盡管軸突刺激無法消除，但這種對RGC體的選擇性刺激有可能減少軸突激活，從而導(dǎo)致更自然的視覺和更少的不規(guī)則感知。

圖5.使用活rd1小鼠進(jìn)行視力恢復(fù)的體內(nèi)實(shí)驗。

最后，作者將具有3D LM微電極的人造視網(wǎng)膜裝置植入體內(nèi)活的rd1小鼠（n=3）中，確認(rèn)感光層完全簡并后進(jìn)行活體小鼠的體內(nèi)視力恢復(fù)實(shí)驗。適配后的結(jié)果顯示該裝置很好地附著在視網(wǎng)膜表面，沒有明顯的損傷或出血（圖5a）。而且，手術(shù)后獲得的橫截面光學(xué)相干斷層掃描圖像表明，3D LM微電極被視網(wǎng)膜組織共形包圍，而沒有塌陷（圖5b）。作者通過恒定光照下誘發(fā)尖峰的電位和發(fā)射速率的實(shí)時跡線以及在該光照期間對發(fā)射速率進(jìn)行了空間映射。通過與無光照明的情況相比證明了該設(shè)備在受刺激的視網(wǎng)膜區(qū)域具有良好的均勻性（圖5c-5e）。此外，作者還使用激光通過橢球形圖案的陰影掩膜選擇性地暴露局部區(qū)域以驗證退行性視網(wǎng)膜反應(yīng)，結(jié)果顯示光照區(qū)域表現(xiàn)出相對較大的視網(wǎng)膜響應(yīng)（圖5f-5g）。值得注意的是，當(dāng)RGC軸突受到電刺激時，電刺激會發(fā)生逆向傳播，導(dǎo)致黑暗狀態(tài)下的錯誤RGC反應(yīng)。最大發(fā)射率（即感受野）的空間分布與這種照明的橢圓形非常相似（圖5h）。而且分類RGC尖峰顯示了與離體結(jié)果相似的體細(xì)胞RGC反應(yīng)的典型波形。為了定量比較激光照射和激光非照射區(qū)域（即黑暗狀態(tài)）的視網(wǎng)膜反應(yīng)，每個記錄電極（像素）的位置被標(biāo)記為索引（圖5i）。然后，對全亮像素（指數(shù)1-9）和暗態(tài)像素（指數(shù)16-36）記錄的最大發(fā)射率進(jìn)行平均。完全暴露區(qū)域的RGC放射性比本底RGC放射性大約高四倍，充分證明了該器件在體內(nèi)應(yīng)用的潛力。

總結(jié)

作者報道了一種柔性人造視網(wǎng)膜，具有直接打印的3D LM微電極，能夠進(jìn)行微創(chuàng)視網(wǎng)膜刺激。體內(nèi)實(shí)驗表明，可見光照明誘導(dǎo)了光線入射的局部視網(wǎng)膜區(qū)域的RGCs的尖峰活動，表明活rd1小鼠具有視力恢復(fù)的潛力。這些結(jié)果對不均勻視網(wǎng)膜變性患者的個性化人工視網(wǎng)膜的開發(fā)具有預(yù)后意義。

作者還探究了設(shè)備尺寸的進(jìn)一步擴(kuò)大和像素數(shù)量的增加使其能夠應(yīng)用于具有更大眼球和更厚視網(wǎng)膜的大型動物模型。減小刺激電極尺寸對于實(shí)現(xiàn)高分辨率刺激至關(guān)重要。作者認(rèn)為，對納米級材料（例如，Pt納米團(tuán)簇）的進(jìn)一步研究，通過在電極表面增加納米級粗糙度來增強(qiáng)刺激效果，可能是一項在未來實(shí)現(xiàn)更有效視力恢復(fù)的具有重要潛力的工作。