解鎖腦功能是探究病理性腦網(wǎng)絡(luò)功能障礙的必要條件。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)和生化的復(fù)雜性，開發(fā)具有預(yù)測(cè)能力的通用模型必須從體外腦網(wǎng)絡(luò)工程入手。基于此，本研究實(shí)現(xiàn)了一個(gè)基于微電極陣列(MEA)的體外腦網(wǎng)絡(luò)，通過體外腦網(wǎng)絡(luò)對(duì)腦功能控制和病理性腦網(wǎng)絡(luò)功能障礙進(jìn)行了研究，并比較了不同類型的神經(jīng)元簇的動(dòng)態(tài)特性。研究結(jié)果顯示，腦起搏神經(jīng)元在產(chǎn)生腦網(wǎng)絡(luò)電生理模式中起著重要作用，并可能與神經(jīng)可塑性過程有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為未來的計(jì)算模型發(fā)展提供了有關(guān)生理和病理?xiàng)l件下腦網(wǎng)絡(luò)行為的重要信息。

微電極陣列(MEAs)上的聚合物裝置：使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)約束來塑造網(wǎng)絡(luò)連通性。本研究實(shí)現(xiàn)了兩種類型的PDMS約束:十字形和圓形掩模。第一種由等臂十字形掩模(圖1a)組成，用于將MEA的有源區(qū)域劃分為四個(gè)部分，實(shí)現(xiàn)四個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(4N)。第二種采用圓形掩模實(shí)現(xiàn)單神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(1N)。兩種類型的掩膜都是通過將PDMS預(yù)聚物和固化劑以10:1的比例混合制成，然后對(duì)準(zhǔn)并可逆地結(jié)合到平面微電極陣列(MEAs)上。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：采用第18-19天的Sprague-Dawley胚胎大鼠(E18-19)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。用E18-19胚胎的大腦皮層制備大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)物。將神經(jīng)元原代培養(yǎng)物置于培養(yǎng)基中培育，使神經(jīng)元組織成形態(tài)和功能成熟的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(圖1b)，再進(jìn)行免疫熒光染色。

圖1.(a)十字形PDMS掩模在MEA上的定位。黑點(diǎn)表示電極位置；左邊的黑色梯形形狀代表參比電極。MEA的有效區(qū)域由1.8 mm×1.4 mm矩形的4個(gè)電極簇組成，其中每個(gè)電極簇由13個(gè)電極組成(?=30μm)，另外7個(gè)電極位于簇之間。(b)具有代表性的四神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(4N)在體外(DIV)18天的免疫熒光圖像，其中樹突狀微管相關(guān)蛋白(MAP2，綠色)和細(xì)胞核(DAPI，藍(lán)色)被標(biāo)記。代表性4N培養(yǎng)物的免疫熒光圖像(c)在DIV 5，(d)DIV 8，(e)DIV 18。在兩個(gè)不同的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(簇)之間建立軸突連接，其中樹突微管相關(guān)蛋白(MAP2，綠色)和軸突微管相關(guān)蛋白(Tau，紅色)被標(biāo)記。在DIV 5移除十字形掩膜。白色的疊加線劃定了之前被十字形掩模占據(jù)的區(qū)域。比例尺:100μm。

數(shù)據(jù)集和實(shí)驗(yàn)方案：本研究中使用的數(shù)據(jù)集包括16個(gè)四網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(4N)和11個(gè)單網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(1N)作為對(duì)照。為了比較4N和1N組件之間時(shí)間序列的激活，將控制網(wǎng)絡(luò)的微電極分組為“虛擬集群”，每個(gè)微電極由13個(gè)單元組成，以保持與4N組件相同的空間組織。此外，為了研究超極化激活的環(huán)核苷酸門控(HCN)通道的作用，記錄了3個(gè)單網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(1N)的活性，通過計(jì)算平均放電速率(MFR)抑制的IC50，得出了HCN抑制劑-伊伐布雷定(IVB)合適濃度的劑量-反應(yīng)曲線。一旦得出這樣的值(15μM)，在1N上進(jìn)行5次記錄以評(píng)估IVB效應(yīng)。

數(shù)據(jù)分析：為了檢測(cè)脈沖的發(fā)生，本研究采用了精確時(shí)間脈沖檢測(cè)(PTSD)算法。

結(jié)果

本研究首先探索并表征了體外互聯(lián)亞群(4N)相互作用所產(chǎn)生的自發(fā)活動(dòng)，指出了它們作為起搏器/優(yōu)勢(shì)群體的作用。結(jié)果與不顯示模塊化連接的皮質(zhì)網(wǎng)絡(luò)(1N)進(jìn)行了比較。直到神經(jīng)元亞群由于PDMS十字形掩膜的存在而保持隔離(圖1a)，它們才在每個(gè)隔室內(nèi)建立了密集的連接(圖1b)；在去除約束后(DIV 5，體外第5天)，種群之間的空間完全沒有任何類型的神經(jīng)性樹枝(圖1c)。隨后，細(xì)胞體開始在裂縫中擴(kuò)展其樹突，在PDMS移除3天后(DIV 8)，神經(jīng)突束開始向其他亞群擴(kuò)展，尋找可能的目標(biāo)(圖1d)。在DIV 18(記錄當(dāng)天)，集群之間的遠(yuǎn)程連接結(jié)構(gòu)良好，足夠豐富，可以保證子種群之間的有效連接(圖1e)，支持物理模塊化連接的證據(jù)。

由模塊化程度調(diào)制的峰值和爆發(fā)特征

獨(dú)立于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)漕愋?即4N或1N)，體外皮層網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)出自發(fā)的電生理活動(dòng)，其特征是豐富的動(dòng)態(tài)庫，從峰值和爆發(fā)信號(hào)到通過網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)的網(wǎng)絡(luò)全局激活。這種行為與耦合到MEA的同質(zhì)網(wǎng)絡(luò)和集群網(wǎng)絡(luò)是一致的。通過比較1N與4N引起的電生理活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)在峰值和破裂活動(dòng)方面存在顯著差異：1N網(wǎng)絡(luò)的MFR值高于4N(圖2a)，MBR(圖2b)和BD(圖2c)也高于1N網(wǎng)絡(luò)。事實(shí)上，IBI值呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)(圖2d)。峰值和爆發(fā)統(tǒng)計(jì)的宏觀指標(biāo)由皮質(zhì)集合的網(wǎng)絡(luò)組織調(diào)節(jié)，而以網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)次數(shù)(NB，圖2e)和網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)持續(xù)時(shí)間(NDB，圖2f)為特征的集體活動(dòng)沒有顯示出顯著差異。

圖2.單網(wǎng)絡(luò)(1N，黑色)和四網(wǎng)絡(luò)(4N，藍(lán)色)組件中的峰值和爆發(fā)活動(dòng)。(a)平均發(fā)射速率(MFR)，(b)平均爆發(fā)率(MBR)，(c)爆發(fā)持續(xù)時(shí)間(BD)，(d)爆發(fā)間隔(IBI)，(e)網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)數(shù)，(f)網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)持續(xù)時(shí)間(NBD)。(a-d、f)每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示相對(duì)于單個(gè)電極的特定度量(MFR,MBR等)的值。(e)每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)相對(duì)于多邊環(huán)境協(xié)定。

由模塊化形成的節(jié)律性活動(dòng)

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)洳]有塑造網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)的宏觀度量(圖2e和2f)，相反，它們的傳播“模式”受到了影響。為了量化電生理活動(dòng)的傳播，本研究估計(jì)了IFR(瞬時(shí)發(fā)射速率)。圖3a顯示了1N控制網(wǎng)絡(luò)的代表性示例。這四條彩色軌跡代表了用于研究網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)的四個(gè)“虛擬集群”。在圖3a所示的代表性實(shí)驗(yàn)中，種群事件遵循順時(shí)針傳播。通過對(duì)集群進(jìn)行顏色編碼，網(wǎng)絡(luò)從紫色集群開始爆發(fā)，然后擴(kuò)散到青色、綠色和紅色集群。另一方面，在圖3b所示的4N中，可以觀察到與在1N中觀察到的相比，簇之間的傳播模式更多變化，更少定型。本研究還表示了三個(gè)網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)的IFR曲線:第一個(gè)網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)顯示了逆時(shí)針傳播，涉及所有四個(gè)相互連接的種群(青色-紫紅色-綠色)，第二個(gè)網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)只涉及三個(gè)亞種群(青色缺失)，第三個(gè)網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)涉及所有隨機(jī)序列的群集(既不是順時(shí)針也不是逆時(shí)針)。

圖3.代表性的(a)單網(wǎng)絡(luò)(1N)和(b)四網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(4N)的60 s電生理活動(dòng)周期。5-s時(shí)間窗對(duì)應(yīng)的瞬時(shí)發(fā)射速率分布在頂部，以及簇激活序列的傳播圖草圖。每種顏色表示一個(gè)“虛擬”(1N)或4N集群，而箭頭表示集群之間的網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)傳播。在1N的情況下，涉及到所有的虛擬集群，而在4N的情況下，第一次和第三次網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)涉及到所有的集群，而第二次網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)沒有涉及到青色集群。

探討與結(jié)論

本研究使用體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞剿髁四X神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的電生理活動(dòng)模式，并揭示了起搏神經(jīng)元活動(dòng)和神經(jīng)可塑性在網(wǎng)絡(luò)行為中的重要性。通過體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可以?duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行精細(xì)控制和觀察，從而深入研究網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)的基本特征。體外模型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)允許研究人員探索拓?fù)溥B接和神經(jīng)可塑性對(duì)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)的影響，為腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)行為的底層機(jī)制提供了重要線索。然而，這項(xiàng)研究是在體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭羞M(jìn)行的，盡管與體內(nèi)情況相似，但仍無法完全模擬大腦的復(fù)雜性。并且在模擬大腦功能和病理?xiàng)l件時(shí)，仍需要更多的研究和實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證體外模型的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

圖4.這項(xiàng)工作的原理和未來展望。主要思想是重新創(chuàng)建與微電極陣列(MEA)耦合的互連神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，以提取、檢查和定量表征其電生理活動(dòng)。利用這種方法，我們可以開發(fā)出再現(xiàn)所觀察到的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)的計(jì)算機(jī)模型(數(shù)字雙胞胎)，從而預(yù)測(cè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的生理行為。從這個(gè)角度來看，計(jì)算模擬有助于理解神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病因和進(jìn)展。

總的來說，本研究證實(shí)了腦起搏神經(jīng)元活動(dòng)和神經(jīng)可塑性在體外神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的自發(fā)活動(dòng)中的重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)具有起搏神經(jīng)元依賴的節(jié)律性和時(shí)空固定的模式，可能與神經(jīng)可塑性有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提供了發(fā)展計(jì)算模型、理解大腦網(wǎng)絡(luò)行為和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要線索。另外，體外模型的應(yīng)用還可以拓展到轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，用于研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機(jī)制和評(píng)估藥物或刺激方案的效果。