【摘要】：H202是生物體系中存在的一種重要小分子，在許多生理過程中發(fā)揮重要作用。對于植物，不利的環(huán)境脅迫包括干旱、洪澇、紫外照射、極端溫度等會導(dǎo)致包含H202作用的植物防御機(jī)制的激活。因此檢測H202在植物的應(yīng)激反應(yīng)過程中的產(chǎn)生和消亡對更好地了解植物的應(yīng)激機(jī)制，對于篩選和培育抗逆性作物具有重要意義。在細(xì)胞水平，正常細(xì)胞中H202含量的升高可以誘發(fā)癌變，H202在腫瘤細(xì)胞中大量積累，并在腫瘤細(xì)胞的生存、增殖和凋亡的調(diào)控過程中發(fā)揮作用。同時(shí)腫瘤細(xì)胞對H202含量的變化非常敏感，H202含量的過度增加或減小都可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

因而，探究抗癌藥物作用下腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生H202的濃度隨時(shí)間連續(xù)變化狀況，對研究腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制，從而預(yù)防和治療腫瘤是極有意義的?；瘜W(xué)發(fā)光法、熒光法和分光光度法等檢測生物體內(nèi)的過氧化氫都需要示蹤物和不穩(wěn)定的化學(xué)探針，這些方法很難做到氧爆發(fā)的動態(tài)在體檢測。另外，這些方法都需要將植物樣品分離或磨碎，并且過程比較復(fù)雜和耗時(shí)。而且，分離組織本身對植物就是一種脅迫，有可能引起植物的包括相關(guān)抗性基因表達(dá)和連續(xù)的生理學(xué)過程等的防御反應(yīng)。此外，考慮到非生物脅迫下的H202水平變化的動態(tài)監(jiān)測，連續(xù)在體檢測更加合適，但是這種測量方式很難通過光學(xué)探針實(shí)現(xiàn)。

因?yàn)榫哂袠O小的體積、良好的生物相容性和較高的靈敏度，微電極和超微電極已經(jīng)被廣泛用于生物在體的電活性小分子檢測。本研究采用電化學(xué)方法，利用納米材料構(gòu)建微電極和超微電極，進(jìn)行植物在體和癌細(xì)胞外的H202的檢測，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：

(1)利用對H202具有較好氧化還原催化能力的血紅蛋白(Hb)修飾碳纖維超微電極，并在單壁碳納米管(SWCNTs)的幫助下不僅保持較高的催化能力而且提高了電子轉(zhuǎn)移速率，降低工作電壓到-O.1V。這樣，在不需要添加氧化還原媒介和額外抗干擾層的情況下，避免了其他電活性物質(zhì)的干擾，構(gòu)建了對H202具有較高靈敏度和選擇性的微型生物傳感器。并成功在體檢測了蘆薈在受到鹽脅迫后連續(xù)19.5小時(shí)內(nèi)的氧爆發(fā)過程。

(2)對H202具有強(qiáng)催化能力的辣根過氧化物酶(HRP)在室溫離子液的幫助下修飾在覆蓋了一層SWCNTs的碳纖維超微電極表面。結(jié)果表明，該修飾電極不僅保持了HRP的氧化還原催化活性，并且對H202具有很高的親和力和靈敏度，檢出限為0.13μM。在沒有外加選擇性滲透膜的情況下對生物環(huán)境中的常見電活性小分子具有很好的抗干擾作用。該傳感器分別成功檢測到HeLa細(xì)胞在刺激劑抗壞血酸，抗癌藥物10-羥基喜樹堿的作用下的H202釋放過程。

(3)為了更加全面了解脅迫條件下植物體內(nèi)小分子的濃度變化狀況，構(gòu)建一種電化學(xué)傳感電極束，與傳統(tǒng)光學(xué)探針方法相比，可在不影響植物生長或不分離植物任何部位的情況下，實(shí)現(xiàn)植物體內(nèi)H202、NO和pH的同時(shí)、實(shí)時(shí)檢測。利用旱脅迫下的油菜作為模式生物，該陣列檢測到了旱脅迫下，NO在旱脅迫開始后11小時(shí)和22小時(shí)處的兩個(gè)較大的峰，分別對應(yīng)3.1μM和2.6μM的NO濃度；H202的含量從旱脅迫開始后20.8小時(shí)開始增加，一直到整個(gè)檢測結(jié)束，其含量在45小時(shí)內(nèi)增加了2.5μM；pH被觀察到在前18小時(shí)相對穩(wěn)定，之后持續(xù)增加。在整個(gè)檢測過程中，油菜莖中的pH增加最大值大約為1.08。由于陣列直徑小于lmm，可以在植物發(fā)育的不同階段實(shí)施實(shí)時(shí)監(jiān)測，并且電極的制作簡單、造價(jià)低、響應(yīng)速度快，該技術(shù)也有望用于幫助理解脅迫信號中的NO、H2O2和pH的相互機(jī)制。

(4)在鉑微柱電極上修飾SWCNTs和Hb，并利用該電極成功檢測到抗旱型油菜和野生型油菜在同樣的旱脅迫條件下的氧爆發(fā)的差異。在野生型油菜中，檢測到在旱脅迫7.8小時(shí)開始出現(xiàn)氧爆發(fā)，并在10.3小時(shí)和26.5小時(shí)分別產(chǎn)生兩個(gè)比較大的峰。和野生型相比，抗旱型油菜在旱脅迫開始后共40個(gè)小時(shí)中只觀察到在15.8小時(shí)處的一個(gè)氧爆發(fā)的峰?？购敌陀筒嗽诤得{迫下的H202積累量比較小，這可能是因?yàn)槠渑cH202清除有關(guān)的酶的活性更高，這也進(jìn)一步解釋了抗旱型油菜在旱脅迫下的較高的存活率。