三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)是生物體的高能磷酸化合物，還可以作為一種重要的信息遞質(zhì)被釋放到細(xì)胞外，在神經(jīng)信息調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答、全身炎癥、組織損傷與死亡、機(jī)體正常發(fā)育與體內(nèi)平衡調(diào)控、細(xì)胞凋亡與腫瘤細(xì)胞清除等生理過(guò)程上有重要作用。然而細(xì)胞ATP釋放機(jī)制及調(diào)控機(jī)理尚不明確，揭示這一機(jī)制對(duì)于理解發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)靶向藥物治療至關(guān)重要，這也是揭開(kāi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之謎的關(guān)鍵，因此實(shí)現(xiàn)原位監(jiān)測(cè)細(xì)胞ATP釋放具有十分重要的意義。基于葡萄糖氧化酶/己糖激酶的電化學(xué)ATP生物傳感器，因其獨(dú)有的高靈敏度、快速響應(yīng)、連續(xù)監(jiān)測(cè)、高時(shí)間和空間分辨率等特性，已用于離體或在體ATP釋放檢測(cè)。細(xì)胞ATP釋放濃度低、釋放速度快，因此具備高靈敏度、低檢測(cè)限、快速響應(yīng)、高選擇性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性好的高性能電化學(xué)ATP生物傳感器以及高分辨、快速、動(dòng)態(tài)原位分析系統(tǒng)極其重要。然而現(xiàn)有研究中存在著微電極制備工藝復(fù)雜、電極有效面積太小、酶活性不高、長(zhǎng)期穩(wěn)定性差等問(wèn)題。

針對(duì)這些問(wèn)題，本論文重點(diǎn)從電極結(jié)構(gòu)和性能設(shè)計(jì)兩個(gè)方面入手，主要開(kāi)展了絲網(wǎng)印刷平面電極H2O2傳感器研究、絲網(wǎng)印刷平面電極ATP傳感器性能優(yōu)化、鉑納米棒修飾平面微電極陣列ATP傳感器研究、3D金-鉑納米花修飾針型微電極ATP傳感器研究、細(xì)胞ATP受激釋放原位監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)及其應(yīng)用研究，并成功用于高鉀溶液誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ATP釋放的原位監(jiān)測(cè)。本論文的主要工作內(nèi)容和創(chuàng)新如下:

(1)提出一步電化學(xué)沉積法固定本征石墨烯納米片，構(gòu)建疊層狀本征石墨烯-殼聚糖復(fù)合膜修飾的絲網(wǎng)印刷平面電極H2O2傳感器，檢測(cè)靈敏度顯著增強(qiáng)，線性范圍寬，檢測(cè)限低。采用掃描電子顯微鏡、傅里葉紅外光譜、拉曼光譜、X射線光電子能譜和電化學(xué)循環(huán)伏安掃描等分析技術(shù)對(duì)復(fù)合膜進(jìn)行表征和研究，并優(yōu)化復(fù)合膜制備條件。H2O2傳感器是葡萄糖氧化酶/己糖激酶電化學(xué)ATP生物傳感器的基礎(chǔ)，深入探討H2O2傳感器機(jī)理，為后續(xù)ATP傳感器研究奠定基礎(chǔ)，且該方法可以推廣到其他納米材料和生物分子的固定化。

(2)實(shí)現(xiàn)絲網(wǎng)印刷平面電極ATP傳感器，從催化層修飾和酶固定化等方面出發(fā)，分別探究了鍍鉑電壓和鍍鉑時(shí)間、戊二醛用量和交聯(lián)時(shí)間、酶層結(jié)構(gòu)和測(cè)試環(huán)境中Mg2+濃度等因素對(duì)傳感器靈敏度的影響并做了優(yōu)化，優(yōu)化后ATP檢測(cè)靈敏度可達(dá)20.1μA mM-1 cm-2。探索了ATP傳感器制備過(guò)程中的關(guān)鍵步驟參數(shù)，為后續(xù)微電極電化學(xué)ATP傳感器制備提供參考。

(3)設(shè)計(jì)并加工平面微電極陣列，實(shí)現(xiàn)鉑納米棒修飾平面微電極陣列ATP傳感器研究，為后續(xù)細(xì)胞ATP釋放監(jiān)測(cè)研究中傳感器修飾提供參考。優(yōu)化金-鉑復(fù)合結(jié)構(gòu)制備條件并實(shí)現(xiàn)可打磨單一超微平面電極ATP傳感器。采用光學(xué)表征驗(yàn)證不同尺寸微圓盤電極的成功制備。進(jìn)一步增加電極表面積和提高傳感器靈敏度，在微電極上修飾鉑納米棒。鉑納米棒的修飾使傳感器靈敏度提高27倍，檢測(cè)限低至20μM。

(4)提出一種簡(jiǎn)易微電極封裝方法和無(wú)模板電沉積層層自組裝3D雙金屬金-鉑納米花結(jié)構(gòu)，構(gòu)建針型微電極高性能電化學(xué)ATP傳感器，有望用于后續(xù)細(xì)胞ATP釋放監(jiān)測(cè)研究。采用掃描電子顯微鏡、能量散射光譜和電化學(xué)阻抗分析等對(duì)納米花進(jìn)行表征，并探究氯金酸濃度和鍍金時(shí)間對(duì)傳感器靈敏度的影響。優(yōu)化后ATP靈敏度為2.28±0.19 nAμM-1 mm-2，線性動(dòng)態(tài)范圍為2.5μM～447μM，檢測(cè)下限為2.5μM(S/N=3)。在4℃的PBS溶液中存儲(chǔ)兩周后，ATP傳感器的葡萄糖靈敏度仍有初始的95.44±6.97%，ATP靈敏度仍有初始的79.39±9.15%。該傳感器檢測(cè)限低、長(zhǎng)期穩(wěn)定性優(yōu)異和選擇性高，源于3D雙金屬金-鉑納米花出色催化活性和較大電活性表面積有助于保持酶活性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

(5)設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞ATP受激釋放原位監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)，并成功應(yīng)用于高鉀溶液誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ATP釋放的原位監(jiān)測(cè)研究。設(shè)計(jì)并完成三電極系統(tǒng)、微操縱臺(tái)及控制器、CCD成像系統(tǒng)和電化學(xué)分析儀器的系統(tǒng)集成。從待測(cè)細(xì)胞選擇、刺激源選擇、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)討論、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性論證及對(duì)比實(shí)驗(yàn)角度，進(jìn)一步完善細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)到的電流下降幅度約為21.6±3.4 nA(N=6)，對(duì)應(yīng)于ATP濃度為12.2±2.8μM，這一濃度與文獻(xiàn)水平一致，均在微摩爾級(jí)別。該原位分析系統(tǒng)可用于進(jìn)一步探究糖酵解和細(xì)胞凋亡過(guò)程中ATP濃度變化，還可為其他神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞分泌物的原位監(jiān)測(cè)研究提供參考。