細菌生物膜或稱細菌生物被膜是指附著于有生命或無生命物體表面被細菌胞外大分子包裹的有一定三維結(jié)構(gòu)和功能的細菌群體，是大多數(shù)微生物在自然界中采用的一種生活方式[1]。生物膜的結(jié)構(gòu)復雜，內(nèi)部分布不均勻。生物膜的結(jié)構(gòu)與細菌種屬和環(huán)境條件息息相關，不同細菌或同一細菌所處環(huán)境不同時，生物膜的疏密和厚薄都會存在明顯差異。由于生物膜中的細菌處在不同時間和空間發(fā)展，因此基因表達和生理活性具有不均質(zhì)性。此外，生物膜具有較高的耐藥性[2]、抗吞噬性[3]以及極強的黏附性[4]，可以導致多種細菌感染性疾病，是細菌感染的重要根源之一。與生物膜相關的細菌感染性疾病的治療極為棘手，目前主要有2種策略：一是抑制生物膜的形成，如應用表面鍍銀和含鈦導管；二是用抗菌藥物來治療已形成的生物膜，如應用抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)、AMPs與抗生素聯(lián)用或借助納米遞藥系統(tǒng)。

1生物膜的形成

生物膜的形成是一個復雜的動態(tài)過程，主要可分為5個階段：1)可逆附著階段，細菌非特異性地附著在底物表面上；2)不可逆附著階段，細菌與底物表面通過黏附素蛋白或黏附因子相互作用；3)微菌落形成階段，細菌產(chǎn)生胞外聚合物；4)生物膜成熟階段，細菌合成并釋放信號分子；5)細菌脫落/擴散階段，細菌離開生物膜，回歸獨立的浮游生活方式。以豬鏈球菌生物膜形成過程為例，如圖1所示。

1：可逆附著reversible attachment；2:不可逆附著irreversible attachment；3:微菌落的形成micro colony；4:成熟maturation；5:細菌脫離/擴散cellular detachment。圖1豬鏈球菌生物膜形成過程示意圖和掃描電鏡圖

1.1生物膜的黏附

細菌在剛接觸物體表面時會借助布朗運動、重力、擴散、對流或內(nèi)在運動來進行可逆性的黏附。當細菌與基質(zhì)表面之間產(chǎn)生的吸引力大于排斥力時，細菌就會在基質(zhì)表面完成附著，但當吸引力小于排斥力時，細胞則無法實現(xiàn)附著，從表面脫落，恢復浮游狀態(tài)。關于細菌如何實現(xiàn)可逆附著，目前存在2種不同的主張:一是認為細菌需要借助黏附素蛋白來完成初始的可逆附著，這一觀點中強調(diào)了黏附素蛋白的特異性選擇，其受體為宿主表面的蛋白、糖蛋白和糖脂。如多糖細胞間黏附素(polysaccharide intercellular adhesion，PIA)是表皮葡萄球菌在醫(yī)療器械上定植的關鍵物質(zhì)[6]；二是認為細菌的不可逆附著過程中不存在特異性選擇，其依靠的是細菌表面的附屬結(jié)構(gòu)及黏附因子的黏合作用，細菌的附屬結(jié)構(gòu)常具有較高的親和性，有試驗證明Ⅳ型纖毛等都具有黏性末端，可以幫助細菌完成黏附[7]，而鞭毛可以加快細菌和表面進行接觸[8]和克服細菌與表面的排斥力。

細菌的可逆性附著會隨著時間的推移變?yōu)椴豢赡娓街豢赡娓街峭ㄟ^短程相互作用實現(xiàn)的，例如偶極-偶極相互作用、氫鍵、離子鍵和共價鍵。不可逆附著可避免細菌本身被帶到不利于自身生長的環(huán)境中，因此，生物膜一旦形成便很難消除。

1.2微菌落的形成

細菌黏附到表面后便開始生長繁殖，同時基因表達上的調(diào)整會促使其分泌大量的胞外聚合物(extracellular polymeric substance，EPS)，其主要由多糖、蛋白質(zhì)和細胞外脫氧核糖核酸(eDNA)組成。EPS構(gòu)成了生物膜三維結(jié)構(gòu)的框架，其可以黏附單個細菌并形成扁平或類似“蘑菇狀”的微菌落，大量菌落堆積使生物膜加厚，進一步增強了細菌對環(huán)境(如抗菌劑、免疫因子、溫度和競爭微生物)的適應能力[9]。因此，EPS分子的產(chǎn)生對生物膜結(jié)構(gòu)十分重要。生物膜的發(fā)展也離不開細菌內(nèi)的信號系統(tǒng)，有研究證明，環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)是細菌在浮游狀態(tài)和固著狀態(tài)之間相互轉(zhuǎn)變的關鍵信號分子之一，可以調(diào)控多種細菌生物膜內(nèi)EPS的分泌和轉(zhuǎn)運[10]。高濃度的c-di-GMP會正向調(diào)節(jié)生物膜的形成，而低濃度的c-di-GMP會對生物膜的形成產(chǎn)生負向影響[11]。

1.3生物膜的成熟

成熟的生物膜微菌落之間圍繞著輸水通道，可以運送養(yǎng)料、酶、代謝產(chǎn)物和排出廢物等[12-13]。這一過程中常伴隨著群體感應(quorum sensing，QS)調(diào)控系統(tǒng)，當細菌合成的信號分子濃度達到閾值水平后，位于細胞質(zhì)或細胞膜中的受體會進行信號分子的識別，并激活相關的基因表達。如群體信號分子AI-2不僅可以促進不可分型流感嗜血桿菌生物膜增厚和成熟，而且在生物膜的發(fā)育和成熟過程中起到防止或延遲生物膜擴散的作用[14]。研究表明，銅綠假單胞菌通過釋放群體感應分子(3-氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯)抑制宿主免疫，從而更好的存活，并且3-氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯在生物膜中細菌內(nèi)積累濃度遠高于浮游細菌內(nèi)的濃度[15-16]，這更直接地表明了群體感應在銅綠假單胞菌生物膜形成中的作用。

1.4細菌脫落/擴散

細菌在浮游狀態(tài)和附著于多細胞群落的生物膜狀態(tài)之間交替存在[17]。當生物膜成熟后，細菌從小菌落中分離出來，移動到新的底物上。這個過程對于生物膜來說也是一種很有效的傳播方式，釋放出的浮游細菌可以進一步的繁殖、遷移，從而形成新的生物膜。擴散是延續(xù)生物膜的一種策略，即生物膜內(nèi)的細菌為適應特定的生理或環(huán)境的變化而啟動的脫落行為[18-19]。

2生物膜的耐藥機制

當浮游細菌形成生物膜后，細菌耐藥性會大幅度增加，Shenkutie等[20]研究了黏菌素、環(huán)丙沙星和亞胺培南對9株鮑曼不動桿菌的最小殺菌濃度(MBC)和最小生物膜清除濃度(MBEC)，結(jié)果表明9個菌株的生物膜細菌產(chǎn)生了高水平的抗生素耐藥性，與浮游細菌相比，根除鮑曼不動桿菌生物膜需要將黏菌素濃度提高64倍，環(huán)丙沙星和亞胺培南濃度提高1 024倍。因此，若想預防或控制生物膜形成，耐藥性是不容忽視的難題。關于生物膜的耐藥機制主要存在以下幾種假說。

2.1抗菌藥物滲透障礙

生物膜對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因之一是藥物滲透性差，這是由于大多數(shù)抗菌藥物擴散和吸附到EPS的能力減少[21](圖2)。

圖2生物膜中的抗菌藥物的滲透障礙

大多數(shù)抗菌藥物受到大小限制難以通過水通道，因此對于包埋于EPS中的細菌來說，EPS相當于一個可以阻礙抗菌藥物滲透的保護屏障，這種阻礙作用會降低與細菌接觸的抗菌藥物的濃度，從而使藥物達不到有效濃度，反而造成了細菌耐藥性的提高。但這一假說并不適用于所有生物膜，如抗生素妥布霉素和環(huán)丙沙星可以穿透生物膜，但未能實現(xiàn)有效殺死細菌[22]。此外，由于細菌及其分泌的黏性基質(zhì)均帶負電，所以親水性抗菌藥物會吸附在表面并形成電荷屏障，阻礙藥物進入菌體發(fā)揮作用[23]。

2.2營養(yǎng)物質(zhì)限制

細菌所處微環(huán)境的pH和氧化還原電位等不同，可使遺傳學上一致的細菌個體表現(xiàn)不同的特性，如產(chǎn)生毒素不同可使生物膜中一些細菌個體對宿主無危害，而另一些細菌則可能對宿主有致命威脅。因此，不均質(zhì)性是細菌生物膜的另一個重要特性，也與細菌的抗性有關。有研究表明，生物膜中的營養(yǎng)物質(zhì)、氧和代謝產(chǎn)物濃度呈現(xiàn)出一種自外向內(nèi)的下降趨勢[24]。這種特殊的微環(huán)境和營養(yǎng)條件導致位于生物膜頂部的細胞具有較好的代謝活性，而其他細菌則處于穩(wěn)定期或生長緩慢[12](圖3)，從而降低了對抗菌藥物的敏感性。部分抗菌藥物可以殺滅最外層敏感性較高的細菌，但只能部分殺滅或無法殺滅敏感性低的細菌。而死亡細菌會成為殘存細菌的營養(yǎng)來源，從而形成新的生物膜。

圖3生物膜中細菌的代謝活性

2.3生物膜中基因表型改變

在形成生物膜時，細菌會由浮游狀態(tài)轉(zhuǎn)變成固著狀態(tài)，這種生長環(huán)境的變化會導致浮游細菌和生物膜細菌之間存在表型差異，具體表現(xiàn)為這2種生活方式的細菌不共享相同的轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組，生物膜內(nèi)細菌對抗菌藥物的敏感性遠低于基因相同的浮游細菌。且生物膜中的細菌比浮游細菌積累突變的速度更快，這些突變會導致抗生素耐藥性的增加[25]。生物膜中積累的突變會加速耐藥菌株的出現(xiàn)，開發(fā)根除生物膜藥物刻不容緩。

2.4產(chǎn)生QS信號

生物膜中的細菌可以利用QS機制產(chǎn)生耐藥性[26]。當生物膜內(nèi)的細菌數(shù)量超過一定閾值時，QS會使一部分細菌脫離表面，轉(zhuǎn)為浮游態(tài)，導致感染擴散或復發(fā)。例如，低劑量的外源AI-2可顯著增強豬鏈球菌的生物膜形成能力，促進耐藥性的產(chǎn)生[27]。目前，有研究證明“淬滅”生物膜中的QS系統(tǒng)可增加生物膜對抗菌藥物的敏感性，如群體感應抑制劑可以降低銅綠假單胞菌對妥布霉素的抗性，但不影響浮游細菌的敏感性[28]。所以，通過抑制QS系統(tǒng)也可以有效控制細菌生物膜形成。

2.5激活嚴緊反應

嚴緊反應是細菌的一種自我保護機制，可以確保細菌在惡劣的外界環(huán)境下存活。當缺乏合成蛋白質(zhì)所必需的氨基酸時，細菌便會停止合成核糖體RNA，發(fā)生空轉(zhuǎn)反應，RelA和SpoT調(diào)控警報素四磷酸鳥苷(ppGpp)和五磷酸鳥苷(pppGpp)的合成，從而引發(fā)細菌的適應性調(diào)控[29]。嚴緊反應在介導生物膜耐藥性上的重要性已經(jīng)得到證實，如氨基酸和葡萄糖缺乏會導致大腸桿菌對氧氟沙星和氨芐青霉素的長期耐受性[30]。Honsa等[31]分離出1株由于RelA錯義突變導致ppGpp水平升高的耐萬古霉素屎腸球菌(VRE)菌株，當在生物膜中生長時，它顯示出對2種抗生素(托霉素和利奈唑胺)的極高的耐藥性。因此，這種依賴于對饑餓條件的生理適應會影響生物膜內(nèi)細菌對抗菌藥物的敏感性，是生物膜產(chǎn)生耐藥性的重要因素之一。

2.6啟動外排泵系統(tǒng)

研究顯示，生物膜內(nèi)細菌中編碼外排泵基因的相對表達量和浮游細菌中的表達量之間存在差異。氟康唑在白色念珠菌生物膜形成早期誘導外排泵編碼基因過度表達[32]；在鮑氏不動桿菌生物膜形成的不同階段，編碼外排泵基因的表達均上調(diào)[33]。由此可以說明，外排泵系統(tǒng)參與了生物膜的形成過程，即細菌通過外排泵系統(tǒng)將抗菌藥物泵出胞外，造成菌體內(nèi)藥物濃度下降。因此，外排泵系統(tǒng)與細菌形成生物膜后的耐藥性密切相關。

2.7分泌抗生素水解酶

分泌抗生素水解酶也是產(chǎn)生耐藥性原因之一，如銅綠假單胞菌生物膜基質(zhì)中分泌的β-內(nèi)酰胺酶，可以降解抗菌藥物，從而阻止這些藥物發(fā)揮作用。Bowler等[34]認為，基質(zhì)中β-內(nèi)酰胺酶的數(shù)量增加會導致成熟的銅綠假單胞菌生物膜對頭孢他啶和美羅培南更具耐藥性。

3 AMPs抗生物膜作用3.1 AMPs

AMPs具有良好的抗生物膜活性，可以抑制和清除生物膜[35-36]。與傳統(tǒng)抗生素相比，AMPs不易產(chǎn)生耐藥性，是極具潛力的抗生素替代物。如螺旋肽G3可以干擾變形鏈球菌生物膜形成的不同階段來抑制變異鏈球菌生物膜的形成。在初始階段，G3通過降低細菌表面電荷、疏水性、膜完整性和黏附相關基因轉(zhuǎn)錄來抑制細菌黏附。在后期，G3與EPS中的eDNA相互作用，破壞成熟生物膜的3D穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，從而分散它們。因此，G3在預防和治療變形鏈球菌生物膜感染方面表現(xiàn)出了巨大的應用潛力[37]。在銅綠假單胞菌生物膜開始生長時添加肽DJK-5和DJK-6，能夠抑制生物膜的形成；在生物膜的結(jié)構(gòu)已經(jīng)明顯時，DJK-5和DJK-6可以分散和根除成熟生物膜中的細菌[38]。肽cCATH-2對浮游菌和生物膜內(nèi)細菌有快速殺滅能力，可以減少細菌最初附著和其他階段的生物量[39]。Moazzezy等[40]發(fā)現(xiàn)，3種人中性粒細胞肽類似物均顯示出對大腸桿菌生物膜的抑制和根除作用?？咕腖L-37在濃度遠小于其MIC時即可破壞鮑曼不動桿菌生物膜，且隨著LL-37濃度的增加，生物膜呈現(xiàn)出遞減的趨勢[41]。P318在0.15μmol/L時可以抑制白色念珠菌生物膜的形成[42]。上述肽的序列和來源詳見表1。

表1肽的名稱、序列和來源

3.2 AMPs與抗生素聯(lián)用

部分AMPs與抗生素聯(lián)用可以表現(xiàn)出很強的協(xié)同作用。青霉素、氨芐青霉素和紅霉素與一系列含色氨酸的AMPs可以協(xié)同抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成[44]。肽DJK-5和DJK-6與幾種常見抗生素(環(huán)丙沙星、頭孢他啶、亞胺培南和妥布霉素)聯(lián)合使用時，抑制生物膜所需的抗生素濃度顯著降低，其中DJK-5與環(huán)丙沙星聯(lián)合抑制銅綠假單胞菌生物膜的FICI值為0.14(FICI指數(shù)為0.5表示良好的協(xié)同作用，相當于每個化合物組合使用時MBIC下降了4倍，F(xiàn)ICI指數(shù)為1.0表示每個化合物組合使用時MBIC下降了2倍)，DJK-6與頭孢他啶聯(lián)用抑制大腸桿菌0157的FICI值為0.35[38]。與生理鹽水組相比，DJK-5和抗生素的聯(lián)合使用明顯減少小鼠皮膚膿腫模型中的細菌總數(shù)，表現(xiàn)出較好治療效果[45]。Zhang等[46]研究了14種抗生素聯(lián)合CRAMP對銅綠假單胞菌生物膜形成的干預作用，最終篩選出以1/4最低抑菌濃度的CRAMP與黏桿菌素結(jié)合可以顯著抑制銅綠假單胞菌生物膜內(nèi)的活菌數(shù)和生物量。Dosler等[47]研究發(fā)現(xiàn)，3種抗生素(妥布霉素、環(huán)丙沙星和黏菌素)分別與LL-37和CAMA存在協(xié)同作用，可以抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，其中環(huán)丙沙星與LL-37/CAMA的協(xié)同效果最好。肽AS10在0.22μmol/L時可以抑制白色念珠菌生物膜，并與兩性霉素B和卡泊芬凈協(xié)同作用于成熟生物膜，F(xiàn)ICI值小于或等于0.5[42]。Chernysh等[48]發(fā)現(xiàn)，肽FLIP7與美羅培南、阿米卡星、卡那霉素、氨芐青霉素、萬古霉素和頭孢噻肟有高度協(xié)同作用，F(xiàn)ICI值小于0.25，且與單獨使用抗生素相比，用FLIP7和抗生素組合處理后的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生物膜內(nèi)的細胞外基質(zhì)、死細胞和活細胞都明顯減少。莫匹羅星與蜂毒素的協(xié)同作用為消除金黃色葡萄球菌生物膜也提供了新的思路[49]。

鑒于生物膜的結(jié)構(gòu)和特點，僅用抗生素很難將其徹底清除，因此將AMPs與傳統(tǒng)抗生素聯(lián)合使用具有完全消除生物膜的可能性，適合用于治療生物膜導致的感染。但目前對于AMPs與抗生素聯(lián)用的研究仍然停留在效應的觀察上，缺乏聯(lián)合作用機制的研究與抗體內(nèi)生物膜研究。

3.3納米遞藥系統(tǒng)

采用納米遞藥系統(tǒng)可以克服AMPs在毒性、對蛋白水解的敏感性和藥代動力方面的不足[50]。納米粒根據(jù)材料來源可分為無機納米粒載體和脂質(zhì)納米粒載體兩大類(表2)。

表2納米粒分類

近幾年對無機納米粒的研究相對較多，如銀納米粒本身就具有較強的抗菌活性和較強的抗菌膜效果，將其和AMPs結(jié)合后還可以提高AMPs的活性[51-52]。Gao等[53]研究開發(fā)了一種可以增強肽P-13抗菌活性的銀納米粒子，其可以提高肽P-13對4種細菌的抗菌活性[53]。脂質(zhì)納米載體可以改善藥物的生物利用度和吸收穩(wěn)定性，實現(xiàn)細菌膜靶向作用，是極有發(fā)展前途的新型藥物傳遞系統(tǒng)，如脂質(zhì)體是最常見脂質(zhì)納米載體。Meng等[54]通過在脂質(zhì)體上修飾靶向基團實現(xiàn)了對EPS的選擇性結(jié)合，進而提高了脂質(zhì)體對細菌生物膜的靶向性結(jié)合。因此，納米粒和AMPs聯(lián)合治療代表了開發(fā)抗生物膜藥物的一種新方法。

4 AMPs抗生物膜機制4.1破壞或降解生物膜內(nèi)細菌的細胞膜電位

革蘭氏陰性菌EPS多由細胞外基質(zhì)多糖組成，如脂多糖、蛋白聚糖、細胞外DNA。這些分子大部分帶負電荷，并且通過電荷排斥和空間位阻抑制抗菌劑的擴散[55]。目前研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)AMPs是通過引起細胞質(zhì)膜去極化，誘導磷脂不規(guī)則分布，抑制重要代謝產(chǎn)物和細胞組分的合成，最終達到殺菌目的[56]。對3種不同結(jié)構(gòu)的細菌素(乳酸鏈球菌素nisin A、乳鏈球菌素lacticin Q和羊毛硫細菌素nukacin ISK-1)的活性和作用方式進行研究，結(jié)果表明它們可以破壞膜電位，導致ATP外流，從而殺滅生物膜細菌[57]。

4.2生物膜基質(zhì)的降解

AMPs還可以作用于生物膜的胞外聚合物基質(zhì)，抑制其產(chǎn)生和積累。例如，肽PI可以降解變異鏈球菌產(chǎn)生的胞外多糖，導致聚苯乙烯或唾液包被的羥基磷灰石上形成的生物膜減少[58]。與上述結(jié)論類似，在人肝源性抗菌肽Hepcidin 20(Hep20)存在下，生物膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，細胞外基質(zhì)明顯減少[59]。

4.3避免細菌嚴緊反應

目前，已有研究表明，在(p)ppGpp缺乏的菌株中，細菌形成生物膜的能力會明顯減弱。因此，通過調(diào)控(p)ppGpp合成酶和水解酶的表達來避免細菌嚴緊反應是抗生物膜的一個有效機制。如SpoT是一種雙功能(p)ppGpp酶，即在營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的條件下SpoT會促進(p)ppGpp合成，在營養(yǎng)物充足時SpoT水解(p)ppGpp以下調(diào)嚴緊反應。肽1018通過下調(diào)SpoT的表達，導致(p)ppGpp降解，從而影響生物膜的形成[60]。

4.4干擾信號系統(tǒng)和下調(diào)負責生物膜形成的基因

抑制c-di-GMP的合成可以干擾生物膜的形成。Foletti等[61]研究發(fā)現(xiàn)，富含脯氨酸的短肽能夠選擇性地結(jié)合細菌第二信使c-di-GMP，從而可以抑制銅綠假單胞菌生物膜的生長。AMPs抑制生物膜形成的另一個機制是影響QS系統(tǒng)，例如LL-37降低了銅綠假單胞菌中與QS相關的基因表達，所以LL-37在低于抑制濃度時可以防止生物膜形成[62-63]。

在形成葡萄球菌生物膜時，PIA是表皮葡萄球菌生物膜發(fā)展過程中至關重要的物質(zhì)，其可以使表皮葡萄球菌相互黏附，從而形成生物膜。PIA由icaABCD操縱子編碼，而icaADBC操縱子由上游基因icaR編碼的阻遏物負調(diào)控[64-65]。有研究發(fā)現(xiàn)，暴露于6倍MIC的hBD-3的菌株組顯著下調(diào)了icaD的表達并上調(diào)了icaR的表達，而抑制icaD的轉(zhuǎn)錄會導致PIA的下調(diào)，從而減少了生物膜的形成[66]。

5小結(jié)

近年來，隨著對細菌生物膜的研究，人們逐漸意識到生物膜感染會造成嚴重的危害。然而傳統(tǒng)抗生素的治療效果較差，且極易造成病原菌的耐藥性，因此急需開發(fā)新型治療生物膜感染的藥物。AMPs具有多種積極的抗生物膜機制，可以抑制或消除生物膜，將其與抗生素聯(lián)用可有效減少抗生素的用量，因此AMPs在治療生物膜感染方面具有廣闊的發(fā)展前景。然而，目前在實際臨床治療中仍存在以下問題亟待深入研究：AMPs自身對血清、蛋白酶敏感和生物安全問題，并且造成感染的常是已經(jīng)成熟的生物膜。所以應重點解決AMPs自身存在的不足，并加強AMPs對已經(jīng)成熟的生物膜的清除作用，以便于將AMPs更好的應用于相關治療。納米遞藥系統(tǒng)可以在一定程度上克服上述缺點，是開發(fā)AMPs抗生物膜藥物未來研究的新方向之一。此外，繼續(xù)深入研究AMPs如何影響生物膜信號傳導、相關基因表達以及作用靶點等問題有助于更合理高效的預防、控制傳染性和致病性生物膜形成，為開發(fā)治療生物膜感染藥物奠定理論基礎。

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