導(dǎo)讀

異養(yǎng)細(xì)菌（HB）普遍存在于厭氧氨氧化工藝中，但其在部分硝化-厭氧氨氧化（PN/A）工藝處理高有機(jī)物廢水中的功能和生態(tài)作用仍未清楚。本研究旨在闡明單級PN/A處理熱水解工藝（THP）-厭氧消化（AD）廢水中的HB活性及其微生物相互作用。PN/A反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)了令人滿意的氮去除率，高達(dá)0.58±0.06 g N/(L·d)，同時(shí)THP-AD廢水中的COD去除率約12%。PN/A反應(yīng)器的N2O排放因子為1.15%±0.18%（處理合成廢水）和0.95%±0.06%（處理消化液）。在反應(yīng)器運(yùn)行過程中，HB和功能微生物（即厭氧氨氧化細(xì)菌和好氧氨氧化細(xì)菌）之間保持著平衡的共生關(guān)系。Anaerolineae spp.的相對豐度明顯增加，而反硝化菌Denitratisoma在處理THP-AD廢水時(shí)略有減少。異養(yǎng)生物對電子供體的偏好解釋了增長趨勢的差異。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

結(jié)果與討論

1 PN/A工藝性能1.1反應(yīng)器性能

PN/A反應(yīng)器已在穩(wěn)定脫氮性能下運(yùn)行170多天（表1）。由于接種厭氧氨氧化顆粒污泥中的AOB豐度低，因此在啟動(dòng)階段I時(shí)優(yōu)化曝氣和進(jìn)水NH4+方案以刺激AOB的生長。間歇曝氣是PN/A運(yùn)行期間有效的曝氣策略，本研究中通過定期打開和關(guān)閉空氣供應(yīng)來采用（表1）。進(jìn)水NH4+濃度在63天內(nèi)從124增加到243 mgN/L，而亞硝酸鹽僅在前30天供應(yīng)。運(yùn)行60天后，出水NH4+濃度低于2 mgN/L（圖1，A），實(shí)現(xiàn)了有效的NH4+去除，表明PN/A工藝完成。NO3-生成與總脫氮比（ΔNO3-/ΔTN）反映了該工藝的生物氮轉(zhuǎn)化，僅考慮AOB和AnAOB活性的情況下，理論ΔNO3-/ΔTN為0.13。在第一階段，ΔNO3-/ΔTN比值在0.15~0.48的范圍內(nèi)變化，高于理論值，表明可能有亞硝酸鹽氧化細(xì)菌（NOB）產(chǎn)生NO3-。隨著NLR的降低，NRR從前32天（有亞硝酸鹽供應(yīng)）的0.94±0.39 gN/(L·d)下降到第52~63天（無亞硝酸鹽供應(yīng)）的0.53±0.08 gN/(L·d)（圖1，B）。

在第二階段（處理RW），進(jìn)水從SW變?yōu)門HP-AD廢水。進(jìn)水COD濃度為547±16 mgCOD/L，COD/NH4+-N比率為2.2±0.1。出水COD濃度為484±52 mgCOD/L，COD去除率約為12%。COD去除率相對低于以往研究（兩階段PN/A系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了50.4%到80%的高COD去除率，而PN反應(yīng)器去除了53%到66%的COD。可能的解釋可能為：（1）與之前的兩階段PN/A系統(tǒng)的PN反應(yīng)器（0.8~2 mgDO/L）相比，本研究中的DO（<0.05 mg/L）較低，好氧階段的氧氣限制導(dǎo)致COD氧化效果較差。（2）與之前的研究相比，THP-AD廢水中有機(jī)物的生物降解性較低。有機(jī)物的可生物降解性高度決定了于厭氧消化效率和穩(wěn)定性，因此不同污水源的有機(jī)物特性不同是合理的。從第74天到第101天，出水NO2-濃度保持相對較低。同時(shí)，出水NO3-顯著減少，導(dǎo)致ΔNO3-/ΔTN比I期低0.16。RW處理期間，體系實(shí)現(xiàn)了令人滿意的NRR（0.58±0.06 gN/(L·d)），與之前實(shí)驗(yàn)室規(guī)模和中試規(guī)模的研究相當(dāng)。

由于從第103天開始出現(xiàn)NO2-積累，在第三階段（后RW處理）將進(jìn)水改為合成廢水。此后，NO2-積累從第132天開始消失。ΔNO3-/ΔTN比值下降到0.09，NRR大大增加到0.91 gN/(L·d)。亞硝酸鹽積累表明NO2-生成率（主要由AOB完成）高于NO2-消耗率（主要由AnAOB完成）。盡管有報(bào)道稱廢水中不溶性有機(jī)物能對AOB產(chǎn)生抑制，但當(dāng)注入THD-AD廢水時(shí)，AOB仍然保持活性。如前所述，在進(jìn)水切換回合成廢水后，亞硝酸鹽積累消失，這表明THP-AD廢水可能抑制了AnAOB活性。

表1操作條件和反應(yīng)器性能總結(jié)。

a R air on:反應(yīng)期間供應(yīng)空氣的時(shí)間百分比。

圖1 PN/A反應(yīng)器性能。A：進(jìn)水和出水中的含氮物質(zhì)。B：氮負(fù)荷和氮去除。C：Rair on（反應(yīng)期間供應(yīng)空氣的時(shí)間百分比）和DO。

1.2細(xì)菌活性

為確定PN/A污泥在不同運(yùn)行階段的細(xì)菌氮轉(zhuǎn)化活性，在反應(yīng)器運(yùn)行期間進(jìn)行了批量實(shí)驗(yàn)測試厭氧氨氧化活性。在第一階段取樣的污泥顯示出高厭氧氨氧化活性（SAA=851±8 mgN/(gVSS·d)）。在第二階段，合成廢水中的SAA降至504±6 mgN/(gVSS·d)，THP-AD廢水中的SAA降至501±55 mgN/(gVSS·d)（圖2）。在第三階段，將進(jìn)水改回合成廢水后，SAA恢復(fù)到558.3 mgN/(gVSS·d)。厭氧氨氧化活性的演變表明，THP-AD廢水可能會(huì)阻礙厭氧氨氧化活性。同樣，之前的一項(xiàng)研究表明，THP-AD中的可溶性有機(jī)物（尤其是不可生物降解部分），直接抑制了AnAOB活性。

圖2 AnAOB的特定細(xì)菌活性和異養(yǎng)反硝化作用。PI：第一期；PII：第二期；PIII：第三期；SW：合成廢水；RW：消化液。

2 PN/A工藝的N2O排放概況

在合成廢水處理（I期）和RW處理（II期）期間監(jiān)測氮形態(tài)和N2O分布（圖3）。雖然曝氣階段的空氣流速為2 L/min，但觀察到的DO較低（0.03 mgO2/L）；在非曝氣階段，DO降至0.01 mgO2/L。循環(huán)開始時(shí)的NO2-濃度為2.8 mgN/L，最大NO2-為13.6 mgN/L。N2O濃度響應(yīng)于曝氣條件（圖3，C）。在曝氣階段，N2O濃度因剝離而逐漸降低，而在非曝氣階段，N2O濃度逐漸增加。在I期，PN/A反應(yīng)器的比凈N2O產(chǎn)率為1.9±0.2 mgN2O-N/(gVSS·d)，N2O排放因子（ΔN2O/ΔNH4+）為1.15%±0.18%。第二階段氮形態(tài)顯示出與第一階段相似的模式，COD在整個(gè)循環(huán)中從544 mg/L下降到456 mg/L（圖3，B）。DO大部分時(shí)間都保持在0.05 mg/L以下，而在最后一個(gè)曝氣階段，由于NH4+耗盡，DO增加到超過1 mg/L的水平。當(dāng)反應(yīng)器加入THP-AD廢水時(shí)，N2O排放因子為0.95%±0.06%，略低于合成廢水。

本研究的N2O排放因子（0.88~1.31%）與之前對不添加COD的一階段PN/A工藝處理合成廢水的研究和處理廢水（1.2%~2%的進(jìn)水TN）相當(dāng)。PN/A工藝中N2O產(chǎn)生的來源主要包括：（1）異養(yǎng)反硝化菌的異養(yǎng)反硝化作用；（2）AOB硝化作用；（3）AOB的硝化反硝化作用。唯一的生物N2O消耗途徑是異養(yǎng)反硝化菌的異養(yǎng)N2O還原。對于不添加COD的PN/A工藝，AOB被認(rèn)為是N2O的主要生產(chǎn)者；而與AOB相比，HB在N2O產(chǎn)生中的作用似乎微不足道。相比之下，以往的研究表明，在存在可生物降解有機(jī)物時(shí)，異養(yǎng)N2O生產(chǎn)為普遍途徑。因此，AOB可能是用合成廢水供給時(shí)PN/A反應(yīng)器中N2O的主要生產(chǎn)者，異養(yǎng)N2O途徑可能在處理RW時(shí)得到促進(jìn)。我們的結(jié)果表明，RW中的N2O排放量略低于合成水，因?yàn)楫愷B(yǎng)N2O途徑受到THP-AD廢水的影響。Zhu和Chen（2011）報(bào)道了污泥RW降低了好氧-缺氧反應(yīng)器的N2O和NO排放，推測污泥廢水中的Cu2+和丙酸增加了N2O還原酶活性與NO還原酶活性的比率，導(dǎo)致N2O排放量減少。同時(shí)，廢水中的有機(jī)物可能會(huì)改變異養(yǎng)N2O生成和消耗途徑的平衡。據(jù)報(bào)道，廢水的低COD/N（0.4）增加了硝化反應(yīng)器中N2O的生成，而充足的有機(jī)物供應(yīng)減少了好氧-缺氧反應(yīng)器和PN/A反應(yīng)器中N2O的排放。因此，異養(yǎng)N2O途徑受THP-AD廢水組分的影響。

圖3 SBR循環(huán)過程中PN/A反應(yīng)器的氮形式和N2O排放分布。A、C：處理合成廢水。B、D：處理THP-AD廢水。

3 PN/A反應(yīng)器微生物群落演替

從反應(yīng)器運(yùn)行周期和粒徑等角度分析了微生物群落組成。16S rRNA測序平均每個(gè)樣本產(chǎn)生了49,383個(gè)讀取，序列聚類后產(chǎn)生1381個(gè)OTU，相似度為97%。通過在至少3個(gè)樣本中設(shè)置高于5的OTU序列來過濾低豐度OTU。過濾后，剩余486個(gè)OTU用于進(jìn)一步分析。在門水平上，綠藻門、變形菌門、擬桿菌門、浮游菌門和酸桿菌門為優(yōu)勢門。在屬水平上，優(yōu)勢屬包括c_Anaerolineae_1、f_Saprospiraceae_1、不動(dòng)桿菌屬、o_Kapabacteriales、Nitrosomonas、Denitratisoma和Candidatus Jettenia（混合污泥，圖4，A）。Nitrosomonas spp.（唯一確定的AOB物種）的相對豐度隨著反應(yīng)器的運(yùn)行而增加，其在接種物中的相對豐度相當(dāng)?shù)停?.7%），但在第166天達(dá)到3.2%（混合污泥，圖4，A）。正如其好氧代謝所預(yù)期的那樣，Nitrosomonas spp.在絮狀污泥（直徑<200μm）的豐度高于顆粒污泥（直徑>200μm）（圖4，B）。另一方面，Nitrospira spp.（NOB）的相對豐度保持在1%以下。因此，通過應(yīng)用間歇曝氣的方法，AOB在PN/A工藝中逐漸富集而沒有NOB富集。我們的結(jié)果與之前的研究一致，表明間歇曝氣是促進(jìn)AOB生長和抑制NOB的有效方法。

Ca.Brocadia是接種物中的主要AnAOB物種（相對豐度7.8%），但在啟動(dòng)階段和RW處理期后其相對豐度大大降低（低至0.1%）（混合污泥，圖4，A）。在后RW處理期間，Ca.Brocadia的相對豐度在第166天逐漸增加，達(dá)到8.8%。相比之下，另一種AnAOB Ca.Jettenia也存在于接種物中（相對豐度2.1%），其豐度在RW處理期間增加，然后在RW后處理期間保持相對穩(wěn)定（混合污泥，相對豐度4.1%）。觀察到的Ca.Brocadia和Ca.Jettenia的差異增長趨勢與AnAOB的生態(tài)位分化理論一致，Ca.Brocadia spp.是通常在高底物環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的r策略者，而Ca.Jettenia spp.是更好地適應(yīng)底物限制環(huán)境的k策略者。接種物富含厭氧氨氧化的污泥適應(yīng)進(jìn)水中足夠的NH4+和NO2-，NLR高達(dá)3.5 gN/(L·d)，適合Ca.Brocadia生長。相反地，PN/A工藝受NO2-限制，因?yàn)镹O2-的產(chǎn)生取決于好氧NH4+氧化速率。這種低底物條件有利于k-策略者Ca.Jettenia的生長。此外，與絮狀污泥中的Ca.Brocadia和Ca.Jettenia相比，顆粒污泥中二者豐度更高（圖4，B）。

HB在PN/A污泥中高度多樣化且含量豐富。Chloroflexi spp.在厭氧氨氧化工藝中廣泛被觀察到，其相對豐度從接種中的32±0%增加到RW處理期間的47±4%，然后在RW處理后進(jìn)一步增加到54±8%。同時(shí)，c_Anaerolineae_1（隸屬于Chloroflexi門）從接種時(shí)期到RW處理期（混合污泥，圖4，A）的豐度由14±3%增加到24±6%，再進(jìn)一步增加到33±8%。有趣的是，c_Anaerolineae_1在顆粒污泥中非常豐富（高達(dá)總?cè)郝涞?4%），而它們在絮狀物中的存在是有限的（低于總?cè)郝涞?%）。變形菌屬也是普遍的種群，其相對豐度從接種物中的22±4%分別下降到RW處理期和后RW處理期的16±1%和15±2%。Denitratisoma隸屬于Proteobacteria，其豐度從接種物中的6±1%分別略微下降到RW處理和后RW處理后的4±1%和4±1%（混合污泥，圖4，A）。Limnobacter屬于Proteobacteria，其在反應(yīng)器運(yùn)行過程中也逐漸減少。Denitratisoma和Limnobacter在顆粒污泥中均顯示出更高的豐度（圖4，B）。

以THP-AD廢水作為進(jìn)水，功能種群（AnAOB和AOB）不斷增長并保持活躍，而HB種群則顯示出不同的增長趨勢。雖然HB和功能性群體對底物存在競爭，但HB和AnAOB之間的代謝相互依賴，例如氨基酸營養(yǎng)共生、亞硝酸鹽循環(huán)或代謝物交換。功能菌群和HB可以在低濃度有機(jī)廢水中共存。先前在兩階段PN/A系統(tǒng)中處理COD/NH4+-N為0.97的廢水的研究表明，Ca.Kuenenia屬保持相對穩(wěn)定，而Brocadiaceae spp.略有下降，Ottowia spp.和Denitratisoma spp.急劇增加。Zhang等人（2020）報(bào)道，進(jìn)水中的低濃度富里酸（25~65 mg/L）促進(jìn)了厭氧氨氧化反應(yīng)器的NRR，而高濃度富里酸（>80 mg/L）抑制了反應(yīng)器的性能。后續(xù)的微生物群落分析表明，Ca.Jettenia和Ca.Kuenenia也能高富里酸中存活下來。據(jù)推測，AnAOB和HB之間的代謝物交換可能有助于AnAOB在不利條件下生存。相比之下，HB可能在過量有機(jī)物存在的情況下強(qiáng)于功能菌群，導(dǎo)致工藝性能惡化。據(jù)報(bào)道，在具有過量易生物降解有機(jī)物和難生物降解有機(jī)物的厭氧氨氧化系統(tǒng)中，異養(yǎng)生物的逐漸生長，HB與AnAOB之間的競爭加劇?？傊ê俊⑸锝到庑院徒M成在內(nèi)的有機(jī)物特征對微生物群落施加不同的選擇壓力，可以重塑功能種群與HB之間的關(guān)系。我們的結(jié)果表明，在處理THP-AD廢水時(shí)，功能種群和HB實(shí)現(xiàn)了平衡的共生并維持了穩(wěn)定的脫氮性能。

通過PCoA分析進(jìn)一步評估了反應(yīng)器運(yùn)行過程中微生物群落組成的演變。結(jié)果顯示來自相同運(yùn)行時(shí)期的污泥樣品之間沒有存在明顯的聚類（圖4，C）。相比之下，基于污泥粒徑的樣品有明顯的分離（圖4，D）。絮狀污泥與顆粒污泥和混合污泥在PCoA 1方向上明顯分離（43.2%解釋度），Nitrosomonas europaea和f_Saprospiraceae對PCoA 1軸的貢獻(xiàn)最大。來自顆粒污泥和混合污泥的樣品沿PCoA 1軸緊密聚集（圖4，D）并沿PCoA 2軸分離。Ca.Jettenia和Thermomicrobiales主要貢獻(xiàn)于PCoA 2軸。這些結(jié)果表明，與絮狀污泥相比，顆粒污泥與混合污泥具有更多的相似性。

圖4 PN/A反應(yīng)器的微生物群落分析。A：混合污泥中微生物群落最豐富的20個(gè)屬；B：絮狀污泥（直徑<200μm）和顆粒污泥（直徑>200μm）中20個(gè)最豐富屬的豐度。C：按運(yùn)行期分組的微生物群落的PCoA分析。D：按顆粒大小分組的微生物群落的PCoA分析。

4 PN/A工藝的代謝潛力

微生物群落的功能由PICRUTs 2預(yù)測，并由KEGG數(shù)據(jù)庫注釋。根據(jù)注釋結(jié)果，碳水化合物代謝、輔因子和維生素的代謝以及能量代謝是主要的預(yù)測途徑。此外，翻譯、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞生長和死亡途徑豐度較高。在PN/A反應(yīng)器運(yùn)行期間，未檢測到微生物代謝的明顯變化。在微生物氮轉(zhuǎn)化潛力方面，發(fā)現(xiàn)了負(fù)責(zé)反硝化、硝化、硝酸鹽同化、異化硝酸鹽還原成銨（DNRA）的基因（圖5，A）。至于硝化潛力，hao基因在反應(yīng)器運(yùn)行過程中逐漸富集并在第100天達(dá)到峰值，這與PN/A反應(yīng)器的好氧NH4+氧化能力增強(qiáng)一致。微生物群落顯示出高反硝化潛力，群落中編碼了完全反硝化途徑（NO3-→NO2-→NO→N2O→N2）。編碼硝酸還原酶（nar）的基因顯示出高豐度，其次是編碼亞硝酸還原酶（nir）、NO還原酶（nor）和N2O還原酶（nos）的基因?？傮w而言，運(yùn)行期間反硝化潛力相對穩(wěn)定。DNRA潛力不容忽視，可能有助于系統(tǒng)氮轉(zhuǎn)化（圖5，A）。

研究檢測了40個(gè)最豐富的OTU的氮轉(zhuǎn)化能力，其中15個(gè)OTU編碼氮轉(zhuǎn)化基因（圖5，B）。Nitrosomonas-AOB編碼amo和hao，顯示完整的NH4+到NO2-途徑。Ca.Jettenia-AnAOB編碼hao和nar。許多編碼nar的OTU，隸屬于Denitratisoma、Limnobacter和f_Commonadaceae，表明它們具有將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的能力。值得注意的是，Denitratisoma編碼nar、nirD和nor，能夠?qū)O3-還原為N2O，這意味著Denitratisoma spp.是N2O生產(chǎn)者，這在之前的研究中也有記載，表明Denitratisoma oestradiolicum可能有助于厭氧氨氧化反應(yīng)器中的N2O生產(chǎn)。注釋為o_Thermomicrobiales_1的高度豐富OTU編碼了nirK，它也可能是N2O生產(chǎn)者。同時(shí)，o_Ignavibacteriales、g_Ignavibacterium和f_Saprospiraceae編碼nos，可能將N2O還原為N2。值得注意的是，根據(jù)PICRUTs 2的基因功能預(yù)測，豐富的異養(yǎng)細(xì)菌Anaerolineae沒有編碼任何氮轉(zhuǎn)化基因。相反，之前的一項(xiàng)研究基于宏基因組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化顆粒污泥（本研究接種物）中的Anaerolineae編碼包括nar和nir的反硝化基因。與此相同，許多研究報(bào)告稱，Anaerolineae編碼反硝化基因并可以進(jìn)行DNRA過程。因此可見，基于16S rRNA擴(kuò)增子測序的功能預(yù)測可能不完整，導(dǎo)致Anaerolineae spp.的氮轉(zhuǎn)化基因在預(yù)測中缺失。

Denitratisoma spp.是微生物群落中豐富且潛在的重要反硝化菌，盡管其豐度在THP-AD廢水運(yùn)行期間略有下降。另一方面，Anaerolineae的豐度則隨著反應(yīng)器的運(yùn)行顯著增加。這種差異可能是由HB對THP-AD廢水中有機(jī)物的適應(yīng)引起的。在厭氧氨氧化工藝中已發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)生物能利用細(xì)胞裂解、腐爛和可溶性微生物代謝物等來源的惰性有機(jī)物作為碳源。Denitratisoma的存在于厭氧氨氧化工藝中得到普遍鑒定，根據(jù)其棲息地的營養(yǎng)狀況，可將其劃分為兼性化學(xué)無機(jī)營養(yǎng)或化學(xué)有機(jī)營養(yǎng)細(xì)菌。

Denitratisoma能使用的電子供體包含易生物降解的有機(jī)物（如VFA）和難以生物降解的物質(zhì)（如對二甲苯和雌酮），其電子受體可以是硝酸鹽和氧。研究表明，兩階段PN/A工藝去除了進(jìn)水中的含氧有機(jī)化合物、蛋白質(zhì)和腐殖質(zhì)，厭氧氨氧化反應(yīng)器中反硝化菌Denitratisoma的豐度增加。因此，Denitratisoma可以通過使用可生物降解的有機(jī)物來適應(yīng)RW水質(zhì)。Anaerolineae spp.隸屬于Chloroflexi，是能夠與DNRA結(jié)合進(jìn)行碳水化合物發(fā)酵的細(xì)絲細(xì)菌。Anaerolineae spp.在厭氧氨氧化工藝中表現(xiàn)出非凡的適應(yīng)性。據(jù)報(bào)道，在處理THP-AD廢水、添加葡萄糖的合成廢水和生活污水的厭氧氨氧化反應(yīng)器中，Anaerolineae spp.豐度增加。發(fā)酵厭氧菌主要依賴于大分子有機(jī)物生長。因此，據(jù)報(bào)道，在厭氧氨氧化工藝中發(fā)現(xiàn)的Chloroflexi spp.能編碼和表達(dá)一系列細(xì)胞外蛋白酶、淀粉酶和細(xì)胞外肽和氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因此，Anaerolineae可能具有在THP-AD廢水中利用有機(jī)物生長的優(yōu)越能力。HB對電子供體的偏好可以解釋微生物種群的差異增長趨勢。這項(xiàng)研究還表明Anaerolineae很好地適應(yīng)了廢水，原因可能是其受益于惰性有機(jī)物質(zhì)。

圖5 PICRUSt 2預(yù)測的微生物群落功能。A：參與氮轉(zhuǎn)化的基因。B：基于PICRUSt預(yù)測的由高豐度OTU編碼的氮轉(zhuǎn)化基因。藍(lán)色表示OTUs編碼了相應(yīng)的基因，淺灰色表示OTUs沒有編碼相應(yīng)基因。

結(jié)論

PN/A工藝在處理THP-AD廢水時(shí)實(shí)現(xiàn)了0.58±0.06 gN/(L·d)的NRR。盡管THP-AD廢水含有高COD濃度，但由于可生物降解的有機(jī)物供應(yīng)有限，THP-AD廢水中的異養(yǎng)反硝化作用可以忽略。THP-AD廢水可能會(huì)影響異養(yǎng)N2O途徑。功能微生物（AnAOB和AOB）在反應(yīng)器運(yùn)行期間保持活躍并不斷增長。Anaerolineae在微生物群落中占主導(dǎo)地位，并在THP-AD廢水處理期間增加，而反硝化細(xì)菌Denitratisoma略有減少。總體而言，HB和功能微生物的平衡共生確保了工藝性能的穩(wěn)定性。