摘要

將海洋橈足類作為活飼料進(jìn)行大規(guī)模養(yǎng)殖需要為最終用戶即孵化場提供可預(yù)測且統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品。對一種以前未描述的大卵型進(jìn)行了表征，其平均直徑為106.5μm，并與連續(xù)培養(yǎng)的唐氏無角蟲的正常卵（82.3μm）進(jìn)行了比較。大卵型明顯大于正常卵，在大約10萬個正常大小的卵中僅發(fā)現(xiàn)1個大卵。正常卵和大卵的平均卵密度分別為1.34±0.16 g/cm3和1.20±0.07 g/cm3。從48小時(shí)內(nèi)孵化成功率相對較低（60%）可以看出，大卵處于休眠狀態(tài)的假設(shè)被否定，因?yàn)閮煞N卵型之間在卵體積、呼吸速率或絨毛膜組織學(xué)分析方面沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。從大卵孵化出的無節(jié)幼體相應(yīng)地較大，橈足類在發(fā)育到成年時(shí)仍然較大。從大卵孵化出的橈足類是可育的，這一事實(shí)表明沒有染色體異常，并表明這種卵型代表卵的上尾端，大小與頻率呈典型正態(tài)分布。下一代的卵子沒有它們起源的卵子大，這表明罕見的大卵子代表了母體效應(yīng)。然而，對于水產(chǎn)養(yǎng)殖中設(shè)計(jì)大型特定物種的活飼料產(chǎn)品而言，大型雞蛋確實(shí)具有有趣的選擇潛力。

1、引言

橈足類被認(rèn)為是地球上最豐富的多細(xì)胞生物（Leandro等人，2006年），具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，是天然魚苗的重要食物來源（H?jgaard等人，2008年；St?ttrup等人，1986年）。這激發(fā)了人們將橈足類用作海洋魚類養(yǎng)殖業(yè)的飼料以提高養(yǎng)殖魚類的存活率和生長率的興趣（Imsland等人，2006；McEvoy等人，1998；Shields等人，1999）。眾所周知，在養(yǎng)殖設(shè)施中，淺海石菖蒲橈足類無角亞種的生長相對簡單，人們對建立高效、經(jīng)濟(jì)、可行的大型無角亞種魚飼料生產(chǎn)有著濃厚的興趣（Abate等人，2014；Drillet等人，2011b；St?ttrup，2000）。

大規(guī)模生產(chǎn)A.tonsa的一個主要挑戰(zhàn)是保持高質(zhì)量雞蛋的生產(chǎn)率，并確保在需要飼料時(shí)獲得足夠和可預(yù)測的孵化成功（H?jgaard等人，2008年）。隨著季節(jié)性和環(huán)境物理?xiàng)l件的變化，自然唐沙蜥種群的產(chǎn)卵量、卵類型及其孵化率和成功率有很大差異（陳和馬庫斯，1997）。在最佳條件下，A.tonsa通常會在產(chǎn)卵后幾天內(nèi)孵化出亞鈦質(zhì)卵（Grice和Marcus，1981）。然而，作為對可預(yù)測的年度不利環(huán)境條件的反應(yīng)，a.tonsa傾向于產(chǎn)生滯育卵（Sullivan和McManus，1986），其中胚胎發(fā)生處于停滯狀態(tài)（Dahms，1995）。滯育是一種克服次優(yōu)自然條件的已知策略（Uye和Fleminger，1976），因?yàn)榧僭O(shè)滯育受母體調(diào)節(jié)，并在孵化前經(jīng)過幾個月的不應(yīng)期（Alekseev等人，2007；Uye，1985）。

亞鈦質(zhì)卵的絨毛膜通常由一層薄的單層卵黃層組成，而滯育卵有一層厚的多層絨毛膜（Castellani和Lucas，2003；Santella和Ianora，1990），在休眠期間保護(hù)卵（Coach等人，2001）。A、tonsa還可以產(chǎn)生第三種休眠卵，稱為延遲孵化卵（DHE）（Drillet al.，2011a）。這些卵的特點(diǎn)是，與亞鈦質(zhì)卵相比，孵化時(shí)間延遲（N48小時(shí)），但孵化延遲比滯育卵短，滯育卵在孵化前可以保持?jǐn)?shù)十年的休眠狀態(tài)（Marcus等人，1994年；Sichlau等人，2011年）。目前，尚不清楚哪些線索導(dǎo)致產(chǎn)生了哪種蛋類型，或者是否同時(shí)產(chǎn)生了幾種蛋類型。因此，雞蛋不僅僅是雞蛋。在水產(chǎn)養(yǎng)殖活飼料大規(guī)模生產(chǎn)中，我們的目標(biāo)是單獨(dú)生產(chǎn)具有恒定特性、孵化模式和質(zhì)量的亞鈦橈足類卵?？梢圆倏v這些亞鈦質(zhì)卵子進(jìn)入和離開靜止?fàn)顟B(tài)，這對于控制儲存和將大量卵子運(yùn)輸給最終用戶至關(guān)重要（Drillet al.，2006）。然而，對橈足類及其卵的特殊吸引特性的探索可能有助于專業(yè)產(chǎn)品的開發(fā)。

本研究描述并描述了在挪威特隆赫姆漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖SINTEF的大型養(yǎng)殖設(shè)施中遇到的一種罕見、大型且以前未描述的蛋型a.tonsa。將這些罕見卵的形態(tài)、組織學(xué)、密度、代謝、孵化成功率和后代與正常大小的卵進(jìn)行比較，并對結(jié)果進(jìn)行討論，以評估這些卵的任何應(yīng)用作用。

2、方法

向A.tonsa（菌株DFH.AT1）培養(yǎng)罐（1600 L，由SINTEF操作）連續(xù)提供昏暗的光線（23°C），并通過自動進(jìn)料泵（約250 L/d）向?qū)?shù)生長的隱生植物波羅的紅單胞菌（約8μm）進(jìn)料，確保恒定的進(jìn)料濃度約30000個細(xì)胞/毫升（Marcus和Wilcox，2007）。每天（0.9升/分鐘）更換培養(yǎng)箱中的總水量，每天采集雞蛋確保了唐沙酵母種群的穩(wěn)定。使用120μm（49%開孔面積）、100μm（44%開孔面積）和64μm（45%開孔面積）篩網(wǎng)（SEFAR NITEX）沖洗和濃縮收獲的雞蛋。

將正常大小的卵子從雌性中分離出來，并在10厘米的皮氏培養(yǎng)皿中保存1-2小時(shí)，保持培養(yǎng)箱的溫度。通過直接從橈足類培養(yǎng)箱底部虹吸收集1-2小時(shí)大的罕見雞蛋，在該培養(yǎng)箱中使用100μm的篩網(wǎng)來沖洗正常大小的雞蛋和碎片。

在進(jìn)行任何測量之前，在解剖顯微鏡下檢查采樣的雞蛋，并將其分為正常大小的雞蛋（~80μm i.d.）和大型雞蛋（~110μm i.d.）。雞蛋、無節(jié)幼體、橈足類和成蟲（見下文）的精確尺寸是使用免費(fèi)軟件“Image J”在固定在光學(xué)顯微鏡上的尼康數(shù)字視覺DS-5米彩色攝像機(jī)（日本尼康）記錄的縮放圖像上確定的。為了排除大雞蛋來自污染培養(yǎng)物的其他龍舌蘭物種，我們必須確定其來源。因此，通過分析從大卵孵化的成蟲的第5對游泳腿（n=7）來確定物種，這是a.tonsa的一個已知關(guān)鍵特征（Enckell，1980；Mauchline，1998），以確保大卵類型確實(shí)來自a.tonsa。

為了確定孵化成功率，用移液管將正常和大雞蛋分別移入塑料孔（1–2 cm3）中，并孵化48小時(shí)（恒定光照、24°C和鹽度25）。48小時(shí)前孵化的雞蛋被稱為亞皮質(zhì)醇雞蛋（Marcus，1979），而活的未孵化雞蛋（48小時(shí)后）被進(jìn)一步孵化30天（17°C，常氧海水，12:12-h暗-光狀態(tài)（Drillet al.，2011a），每隔一天將雞蛋輕輕轉(zhuǎn)移到有新鮮海水的井中，以減少細(xì)菌的發(fā)育）測定延遲孵化雞蛋（DHE）或在黑暗中冷卻至2°C 30天，并在24°C下重新孵化（Marcus和Fuller，1986；Schneiderman和Williams，1953），測定滯育雞蛋。

同樣的程序也適用于從大型卵型孵化的橈足類（大約10個兩性個體）產(chǎn)生的卵（n=105）。2012年10月至2013年10月期間，對A.tonsa卵進(jìn)行了所有采樣和測量。

2.1.納米呼吸計(jì)

耗氧量被認(rèn)為是整體代謝活動和石菖蒲蛋、胚胎和幼蟲表現(xiàn)的最佳指標(biāo)（Leese，2003；Lopes等人，2005；Marsh等人，1999；Romano等人，1996）。使用定制的Clark型O2微電極，通過商用納米呼吸計(jì)裝置（Unisense a/S，Aurhus N，Denmark）測量新采集的單獨(dú)選擇的正常和大型雞蛋的耗氧率，見Nielsen等人（2007）。

2.2.雞蛋密度測量

根據(jù)在10 cm長的方形毛細(xì)管（透明熔融石英，cm-Scientific）中測量的自由落體速度確定兩種蛋類型（45個大蛋和49個正常大小蛋）的密度，內(nèi)徑為5×5 mm，大蛋的蛋：管直徑比為0.022，正常蛋為0.016，足以排除毛細(xì)管壁對下沉雞蛋的阻力（Happel和Brenner，1965；Huang和Feng，1995）。將毛細(xì)管連接到放置在充分混合的恒溫水?。}度25）中的聚苯乙烯泡沫塑料上。通過連接到蠕動泵的玻璃移液管收集單個雞蛋，移液管尖端放置在毛細(xì)管上。當(dāng)卵子從玻璃移液管中釋放時(shí)，使用解剖顯微鏡觀察卵子。如聚苯乙烯泡沫塑料上的標(biāo)記所示，使用秒表在1厘米的距離上測量穩(wěn)定下沉率。根據(jù)下沉速度，使用斯托克斯定律（已知介質(zhì)的動態(tài)粘度和密度），并使用測量的正常雞蛋和大雞蛋直徑，計(jì)算雞蛋密度。

2.3.組織學(xué)分析

將選定的正常和大雞蛋加入2%瓊脂糖中，然后冷卻至5°C 24小時(shí)，形成約1 cm3的瓊脂糖凝膠塊。然后將區(qū)塊固定在2.5%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.11 M Hepes緩沖液中，并在5°C下儲存。然后將雞蛋嵌入環(huán)氧樹脂包埋介質(zhì)（試劑盒45359-1EA-F）中，并在60°C下干燥24小時(shí)，然后切出1μM薄片（硅藻組織刀，編號HI 1746，尺寸6）（德國萊卡莫斯克羅系統(tǒng)公司），用甲苯胺藍(lán)染色，并在光學(xué)顯微鏡（100倍放大）（蔡司Axioskop 2 plus，蔡司公司，德國）中進(jìn)行分析，該顯微鏡配有數(shù)字瞄準(zhǔn)鏡DS-5 M彩色攝像機(jī)（日本尼康）。

2.4.統(tǒng)計(jì)數(shù)字

在確定均值和標(biāo)準(zhǔn)差時(shí)進(jìn)行單向方差分析（ANOVA），然后在樣本量較小時(shí)進(jìn)行配對t檢驗(yàn)（nb 30）。通過檢驗(yàn)正常蛋和大蛋耗氧量的方差相等性（f檢驗(yàn)），驗(yàn)證了顯著差異。在每次數(shù)據(jù)分析之前，使用α=0.05的顯著水平測試正態(tài)性。

3、結(jié)果

3.1.正常和大型卵的形態(tài)特征

對從培養(yǎng)箱中收獲的大批量A.tonsa雞蛋進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)一些異常大的雞蛋。在5個單獨(dú)的日子里，共調(diào)查了10批46×106個雞蛋，共觀察到587個異常大的雞蛋（圖1A）。大卵與正常卵的平均±SD比為1:10.3×104±1:5.6×104。在兩個隊(duì)列（圖1D和E）的雞蛋子集上測量正常雞蛋的準(zhǔn)確雞蛋直徑，正常雞蛋的平均值為82.3±3μm（n=315），大雞蛋的平均值為106.5±4.6μm（n=119）。這種差異是顯著的（圖1E和F）。

圖1。大而正常的唐氏無刺蟲卵（A）（比例尺：100μm），橫切面顯示正常（B）和大（C）卵的絨毛膜厚度。未經(jīng)篩分的雞蛋（D）、100μm篩網(wǎng)篩分的雞蛋（正常大小的雞蛋）（E）和100μm篩網(wǎng)保留的雞蛋（大型雞蛋）（F）的雞蛋直徑的頻率分布。

高分辨率顯微鏡研究表明，兩種卵子類型之間的絨毛膜成分或壁厚沒有任何明顯差異，呈單層（圖1B和C）。這兩種卵子都有多刺的外殼，但大卵子的棘更長、更豐富。兩種卵子類型均為球形，測量的卵子直徑中不包括棘。正常和大型雞蛋的平均±SD密度分別為1.34±0.16 g/cm3（n=49）和1.20±0.07 g/cm3（n=45）。這些值有顯著性差異（ANOVA，p＜0.05）。

3.2.兩種雞蛋的耗氧率

對于這兩種卵型，耗氧率逐漸增加，直到孵化時(shí)，即產(chǎn)卵后15-17小時(shí)。在這一點(diǎn)上，無節(jié)幼體游出孵化室，氧氣消耗下降到非常低的水平（圖2）。我們假設(shè)，孵化后留下的有機(jī)物質(zhì)的微生物礦化偶爾會維持室內(nèi)較低但較高的O2消耗（圖2）。

圖2。48小時(shí)內(nèi)單個正常和大型雞蛋的耗氧量曲線。箭頭指示孵化點(diǎn)。

大雞蛋的耗氧率是正常大小雞蛋的2倍，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（方差分析和t檢驗(yàn)，p＜0.05）。在平均±SD下，大卵孵化前2小時(shí)的耗氧率為28±12 pmol O2?1個雞蛋?1小時(shí)?1（n=13），而正常大小的卵子的值僅為12±3 pmol O2?1個雞蛋?1小時(shí)?1（n=12）（圖3A）。然而，兩種雞蛋類型的平均±SD體積比O2消耗率相似；41.8±9.2和45.04±18.4 nmolO2?1毫米3?1小時(shí)?正常雞蛋和大雞蛋分別為1（圖3B）。

圖3。（A）平均±SD胚胎耗氧率（nmolO2?1個雞蛋?1小時(shí)?1）對于正常和大型雞蛋，孵化前2小時(shí)。（B）平均±SD胚胎氧體積比消耗率（nmolO2?1個雞蛋?1小時(shí)?1）對于正常和大型雞蛋，孵化前2小時(shí)。星號表示顯著差異。

在所有用于O2測量的雞蛋中，86%的正常大小的雞蛋在48小時(shí)內(nèi)孵化，而只有52%的大雞蛋在同一時(shí)間內(nèi)孵化。顯然，在給定的條件下，大卵具有更長的發(fā)育階段（胚胎發(fā)生）。然而，對于未用于O2孵化的大型雞蛋，48小時(shí)后孵化成功率分別為91%（n=285）和60%（n=306）。在接下來的48小時(shí)內(nèi)，這兩種類型的大多數(shù)剩余雞蛋逐漸解體。沒有對這些“老雞蛋”進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查。