隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，我們對(duì)微生物的認(rèn)識(shí)逐步深入，微生物在臨床以及科研上的應(yīng)用越來(lái)越多，而微生物采樣的正確與否直接關(guān)系到微生物數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。因此，微生物的采樣方法就顯得格外重要。

首先，我們需要在取樣的過(guò)程中，注意以下幾個(gè)方面：

(1)所有實(shí)驗(yàn)用到的取樣用具必須是經(jīng)過(guò)滅菌的（如樣品袋、取樣器、采血管、試管、鏟子、匙、刀類工具等）。

(2)收集樣品信息，取樣前或取樣后應(yīng)在盛裝樣品的容器或樣品袋上立即貼上標(biāo)簽，每件樣品必須標(biāo)記清楚（例如品名、來(lái)源、數(shù)量、取樣地點(diǎn)、取樣人及取樣日期等）。

(3)請(qǐng)盡量將樣本分裝3-5份備份；建議每組取6個(gè)及以上重復(fù)較為合適，至少3個(gè)重復(fù)。

(4)用到谷禾取樣管的實(shí)驗(yàn)樣品，可以常溫運(yùn)輸；如果不用取樣管，則必須低溫-80℃保存，保存期間切忌反復(fù)凍融；低溫寄送時(shí)請(qǐng)將樣品置于泡沫箱中，用干冰寄送。

然而樣品種類繁多，不同的樣品取樣有不同的方案，下面詳細(xì)介紹每類樣品對(duì)應(yīng)的取樣方案。

環(huán)境微生物

普通土壤

(1)去除表面浮土、凋落物等，根據(jù)土壤情況，選擇是否過(guò)2mm篩網(wǎng)，每個(gè)樣品從3個(gè)及以上采樣點(diǎn)采集并混合而成，建議將樣本分裝3-5份備份；

注：采樣時(shí)需注意每個(gè)采樣點(diǎn)的取土深度及采樣量應(yīng)均勻一致，土樣上層與下層的比例要相同。

(2)保存于無(wú)菌離心管中，置于泡沫箱（冰袋或干冰）中，0°C以下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室；

(3)如果條件不允許立即提DNA，可將樣品置于-80°C冰箱中保存，并通過(guò)干冰寄送至公司后提取樣品總DNA。

根際土壤

根際，是指受植物根系活動(dòng)影響，在物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)上不同于土體的那部分微域環(huán)境。部分研究是針對(duì)土壤微生物與植物之間的相互關(guān)系，因此需要對(duì)根際土進(jìn)行取樣。

(1)采集植株，去除根周較松散的土，仍附著在根系表面的視為根際土。將植物置于裝有冰袋或干冰的保溫箱中，避光條件，0℃以下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室；

(2)準(zhǔn)備無(wú)菌容器，將植物根系部分置于緩沖液（PBS或生理鹽水）中震蕩，震蕩時(shí)間和強(qiáng)度依據(jù)樣本實(shí)際情況調(diào)整，洗下根際土；

(3)將洗滌液進(jìn)行高速離心，收集土壤沉淀，若沉淀較少，也可過(guò)濾膜，同一樣方取樣的樣本進(jìn)行多點(diǎn)等量混合；

(4)將樣本分裝至離心管中，密封，標(biāo)記樣本信息后液氮速凍，置于-80℃冰箱保存，干冰寄送。

水體沉積物、底泥

采集水底沉積物5~10 g（具體深度依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定），保存于凍存管中，標(biāo)記好樣本信息后液氮速凍或置于裝有干冰的泡沫盒中，黑暗環(huán)境下，盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-80℃冰箱保存，干冰寄送。

活性污泥

多點(diǎn)取樣并等量均勻混合至約10 ml的懸浮污泥樣本（5~10 g沉降物），保存至凍存管中，標(biāo)記好樣本信息后液氮速凍或置于裝有干冰的泡沫盒中，黑暗環(huán)境下，盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-80℃冰箱保存，干冰寄送。

水體

(1)采集水樣應(yīng)注意無(wú)菌操作，以防止雜菌混入。

(2)根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置，選取適當(dāng)孔徑的濾膜，使用水體抽濾機(jī)抽濾1~100 L水體（不同水質(zhì)間差異極大），或抽濾至濾膜上可見明顯覆蓋物。

對(duì)于渾濁水體，建議過(guò)濾前靜置分離懸浮顆粒物，先用大孔徑濾膜過(guò)濾一遍，再用小孔徑濾膜過(guò)濾。

(3)標(biāo)記好樣本信息后液氮速凍或置于裝有干冰的泡沫盒中，黑暗環(huán)境下，盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-80℃冰箱保存，干冰寄送。

注：根據(jù)水體中微生物含量不同，取樣量有所不同：污水等菌群豐富的水體用量一般為200-1000 ml，湖泊、河流等自然水體一般為1-2 L，自來(lái)水等菌群含量較低的水體則一般為1-5 L，海洋水體隨著地理位置、季節(jié)和取樣深度浮動(dòng)較大。

食品

包裝食品

盡可能取原包裝，檢驗(yàn)前不要開封，以防污染。

大塊冷凍食品，應(yīng)從幾個(gè)不同部位用滅菌工具取樣，使樣品具有充分的代表性；

在將樣品送達(dá)實(shí)驗(yàn)室前，要始終保持樣品處于冷凍狀態(tài)。樣品一旦融化，不能再凍，保持冷卻即可。

液體食品

通常情況下，液態(tài)食品較容易獲得代表性樣品。

盛放在大罐中的液態(tài)食品（如牛奶、奶昔、飲料等），取樣時(shí)可連續(xù)或間歇攪拌；

盛放在小容器的液態(tài)食品，可在取樣前將液體上下顛倒，使其完全混勻。較大的樣品要放在已滅菌的容器中送往實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室在取樣檢測(cè)之前應(yīng)將液體再?gòu)氐谆靹蛞淮巍?

對(duì)于牛奶、葡萄酒、植物油等，常采用虹吸法（或用長(zhǎng)形吸管）按不同深度分層取樣，并混勻。如樣品粘稠或含有固體懸浮物或不均勻液體應(yīng)充分?jǐn)噭蚝?，方可取樣?

半固體食品

用無(wú)菌操作開啟包裝，此類樣品無(wú)法用吸管吸取，可用無(wú)菌勺子從不同部位挖取樣品，放入無(wú)菌盛樣容器。若樣品是粉末，應(yīng)邊取邊混合。

固體食品

面粉或奶粉等易于混勻的食品，其成品質(zhì)量均勻、穩(wěn)定，可以抽取小樣品（如100g）檢測(cè)。但散裝樣品必須從多個(gè)點(diǎn)取大樣，且每個(gè)樣品都要單獨(dú)處理，在檢測(cè)前要徹底混勻，并從中取一份樣品進(jìn)行檢測(cè)。

肉類、魚類或類似的食品既要在表皮取樣又要在深層取樣。深層取樣時(shí)要小心不要被表面污染，同時(shí)避免使之暴露在空氣當(dāng)中。

有些食品，如鮮肉或熟肉可用滅菌的解剖刀和鉗子取樣；冷凍食品可在未解凍的狀態(tài)下可用鋸子、木鉆或電鉆（一般斜角鉆入）等獲取深層樣品；全蛋粉等粉末狀樣品取樣時(shí)，可用滅菌的取樣器斜角插入箱底，樣品填滿取樣器后提出箱外，再用滅菌小勺從上、中、下部位取樣。

注：

·注意不要使固體樣品過(guò)度潮濕，以防食品中固有的細(xì)菌滋生。

·食品如為非冷藏易腐食品，應(yīng)迅速將所取樣品冷卻至0℃~4℃；若樣品是冷凍的，應(yīng)保持冷凍狀態(tài)，低溫寄送。

植物內(nèi)生菌

植物內(nèi)生細(xì)菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，直接對(duì)植物組織樣本進(jìn)行測(cè)序分析，可以研究植物內(nèi)生細(xì)菌或真菌的多樣性。

(1)根據(jù)研究對(duì)象選取新鮮植物組織（如果是植物根部，需去除根表粘附土壤）；0℃以下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室；

(2)根據(jù)組織大小剪成小塊或小段（至少兩邊不超過(guò)0.5cm），在無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌水對(duì)植物組織進(jìn)行洗滌30s；

(3)表面無(wú)菌化處理：

第一次消毒：75%無(wú)水乙醇浸泡1min；第二次消毒：2%次氯酸鈉處理3min，轉(zhuǎn)入75%無(wú)水乙醇浸泡30s，接著用無(wú)菌水漂洗3次；

(4)進(jìn)行核酸提取實(shí)驗(yàn)或液氮速凍，放置-80℃冰箱保存。干冰寄送。

動(dòng)物腸道內(nèi)容物

(1)用無(wú)菌手術(shù)刀挖取（或無(wú)菌鑷子擠出，也可用無(wú)菌生理鹽水沖洗出）腸道內(nèi)容物；

(2)直接用谷禾取樣盒里的棉簽沾取約黃豆大小的腸道內(nèi)容物，將沾取內(nèi)容物的棉簽浸入取樣管液體攪拌洗脫內(nèi)容物進(jìn)入取樣管保存液內(nèi)；攪拌約30-40s，然后丟掉棉簽，將管子蓋子擰好，快速搖晃取樣管至少30秒；

(3)觀察到管內(nèi)液體帶有明顯腸道內(nèi)容物顏色即取樣成功，常溫寄送。

人和其它動(dòng)物糞便

(1)使用前請(qǐng)洗凈雙手，防止雜菌干擾。將取樣管取出，擰開蓋子。

(2)用取樣棉簽沾取少量新鮮糞便(需要量為黃豆一綠豆大小)；如糞便較干，可先將棉簽在取樣管中浸濕后沾?。?

(3)將沾取糞便的棉簽浸入取樣管液體攪拌洗脫糞便進(jìn)入取樣管保存液內(nèi)，攪拌約30-40s，然后丟掉棉拭子，將管子蓋子擰好，快速搖晃取樣管至少30秒；

(4)觀察到管內(nèi)液體帶有明顯糞便顏色即取樣成功，常溫寄送。

注：

·如3天內(nèi)使用過(guò)抗生素類、質(zhì)子泵類胃藥、阿片類精神藥物請(qǐng)停藥3天后再檢測(cè)。

·感冒、腹瀉或其他癥狀期間不影響取樣,拉稀或稀便可以用棉簽反復(fù)沾取糞便至取樣管。

·如長(zhǎng)期便秘?zé)o排便可使用開塞露等輔助手段獲取糞便樣本。

·取樣無(wú)時(shí)間和飲食限制,但是取樣前最好正常飲食。

·完成取樣后樣本可常溫有效存儲(chǔ)一周,為保證檢測(cè)時(shí)效請(qǐng)完成取樣后盡快送回。

口腔

口腔拭子

(1)采樣前30分鐘禁食、禁煙酒等；

(2)準(zhǔn)備一杯清水（約150ml），將清水含入口中，充分洗漱口腔約10秒，重復(fù)2-3次。

(3)將拭子伸入口腔，使拭子頭充分接觸左側(cè)口腔內(nèi)壁，上下牙床處粘膜，用適當(dāng)力度上下擦動(dòng)并旋轉(zhuǎn)拭子15-20圈。用同樣方法在右側(cè)口腔內(nèi)壁及上下牙床粘膜處進(jìn)行另一根拭子的采樣。

(4)將拭子置入取樣管保存液內(nèi)，攪拌約30-40s，然后丟掉拭子，將管子蓋子擰好，快速搖晃取樣管至少30秒；常溫寄送。

咽拭子

(1)采樣前30分鐘禁食、禁煙酒等；

(2)準(zhǔn)備一杯清水（約150ml），將清水含入口中，充分洗漱口腔約10秒，重復(fù)2-3次。

(3)將采集對(duì)象舌頭外拉，使懸雍垂盡可能向外牽引。同時(shí)，將拭子越過(guò)舌根到咽后壁或者懸雍垂后側(cè)，反復(fù)擦拭15次以上，避免接觸舌、口腔粘膜和唾液。

(4)將拭子置入取樣管保存液內(nèi)，攪拌約30-40s，然后丟掉拭子，將管子蓋子擰好，快速搖晃取樣管至少30秒；常溫寄送。

唾液取樣

(1)采樣前30分鐘禁食、禁煙酒等；

(2)準(zhǔn)備一杯清水（約150ml），將清水含入口中，充分洗漱口腔約10秒，重復(fù)2-3次。

(3)用舌尖抵住上顎或下顎齒根以富集唾液，向取樣管中輕輕吐入唾液，直至液體唾液（非氣泡）達(dá)到2ml以上。攪拌約30-40s，快速搖晃取樣管至少30秒；常溫寄送。

牙菌斑取樣

(1)采樣前30分鐘禁食、禁煙酒等；

(2)準(zhǔn)備一杯清水（約150ml），將清水含入口中，充分洗漱口腔約10秒，重復(fù)2-3次。

(3)用棉卷隔濕所采集的牙齒，再以無(wú)菌生理鹽水沖洗牙面，用無(wú)菌挖匙或探針采集窩溝菌斑或唇頰面菌斑；以牙線置于兩鄰牙之間，緊貼牙面采集鄰面菌斑。采集后放入含有保存液的取樣管內(nèi)，攪拌約30-40s，快速搖晃取樣管至少30秒；常溫寄送。

皮膚

一、樣本篩選

如果受試者存在以下情況，則需剔除：

(1)采樣前7天，臉部，頭皮，脖子，胳膊，前臂或者手使用過(guò)抗生素或者萜類物質(zhì)者；

(2)臉部，胸部，背部或者肩膀有痤瘡者；

(3)頭皮，臉，脖子，手臂，前臂或者手上有水泡，膿皰，瘡，膿腫，腐爛或者潰瘍者；

(4)在取樣部位處有一處水泡，膿皰，瘡，膿腫，腐爛，潰瘍，蘚，傷口，裂紋或者色素及粉紅色的皮膚修復(fù)區(qū)者；

(5)身上有多處粉色或紅色皮膚區(qū)域者（暗指牛皮癬或者濕疹患者）；

(6)手掌或者腳掌皮膚增厚或者有裂紋者；

(7)兩周之內(nèi)，每天使用去屑洗發(fā)水都不能清理干凈頭皮屑者；

(8)身體一處或者多處有散發(fā)型皮疹者。

二、收集方法

(1)將拭子在無(wú)菌生理鹽水或清水中浸濕，在實(shí)驗(yàn)?zāi)康膮^(qū)域擦拭10s；

(2)樣本采集后立即將拭子置入取樣管保存液內(nèi)，攪拌約30-40s，然后丟掉拭子，將管子蓋子擰好，快速搖晃取樣管至少30秒；常溫寄送。

人體其它部位

組織

(1)取相應(yīng)部位組織樣品，于無(wú)菌操作臺(tái)上解剖，用滅菌剪刀、解剖刀切取指甲蓋大小左右組織塊；

(2)將組織塊放入凍存管中并蓋緊蓋子，標(biāo)記好樣本信息。樣品液氮速凍后放入-80℃冰箱保存。干冰寄送。

肺泡灌洗液

(1)口咽部進(jìn)行霧化利多卡因麻醉后，滴注120-300mL無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行BAL液體標(biāo)本的收集。取樣后離心，去掉上清，取沉淀物。

(2)用液氮速凍-80℃保存，干冰寄送；或取沉淀物洗脫置取樣管，攪拌約30-40s，快速搖晃取樣管至少30秒，常溫寄送。

腸道灌洗液

(1)收集腸道灌洗液，過(guò)膜；或者將腸道灌洗液離心，棄上清，取沉淀物。

(2)用液氮速凍-80℃保存，干冰寄送；或取沉淀物洗脫置取樣管，攪拌約30-40s，快速搖晃取樣管至少30秒，常溫寄送。

生殖道

(1)采用無(wú)菌棉拭子，沿著陰道口、陰道中部和后穹窿內(nèi)腔壁旋轉(zhuǎn)拭子做圓周運(yùn)動(dòng)數(shù)次。

(2)擦拭后立即將拭子浸入取樣管中的保存液中，攪拌約30-40s，快速搖晃取樣管至少30秒，常溫寄送。

血液

(1)成人10-20ml（兒童1-3ml）全血收集到真空采集管（已加入抗凝劑），上下顛倒兩次。

(2)標(biāo)記信息，低溫保存，干冰寄送。

乳汁

(1)洗凈雙手，母乳期用無(wú)菌水擦拭乳頭，取乳汁5-10ml 3管（除掉第一管）。

(2)低溫（-20℃）保存，干冰寄送；或者用拭子沾取乳汁后，立即將拭子浸入取樣管中的保存液中，攪拌約30-40s，快速搖晃取樣管至少30秒，常溫寄送。

腹水

(1)收集腹水10-20ml，離心，棄上清，取沉淀物。

(2)用液氮速凍-80℃保存，干冰寄送；或取沉淀物洗脫置我們的取樣管，攪拌約30-40s，快速搖晃取樣管至少30秒，常溫寄送。

膽汁

(1)膽汁樣本由十二指腸引流法或膽囊穿刺法或手術(shù)中留取膽汁，采集膽汁量為5ml，置無(wú)菌管內(nèi)，離心，棄上清，取沉淀物。

(2)用液氮速凍-80℃保存，干冰寄送；或取沉淀物洗脫置我們的取樣管，攪拌約30-40s，快速搖晃取樣管至少30秒，常溫寄送。

尿液

(1)采集中段尿液40 ml左右。（中段尿：在排尿過(guò)程中，棄去前、后時(shí)段排出的尿液，以無(wú)菌容器收集）；

(2)一般留取清晨第一次尿液，最好憋尿6小時(shí)。住院患者可以直接取晨尿，患者將晨尿的中段尿收集至無(wú)菌杯中40 ml為宜；門診患者或健康人等無(wú)尿意者，可以適量飲水，在有尿意時(shí)盡可能的多憋一段時(shí)間，將尿液的中段尿收集至無(wú)菌尿杯中40 ml為宜；

(3)離心，去上清，加入我們的液體保存，常溫寄送。

注：

·應(yīng)在抗生素使用前或停用抗生素藥5天后留尿液標(biāo)本。

·對(duì)于小便輕度失禁患者或者憋尿時(shí)間過(guò)長(zhǎng)患者，對(duì)中段尿比較難控制的情況下，我們可以告知患者在排尿過(guò)程中3 s后采集尿液。

·如果是病?；蚧杳圆∪?，可由相關(guān)醫(yī)務(wù)人員用導(dǎo)尿方法采集尿液，此操作過(guò)程中要嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，避免因?qū)虿簧鞫鴮?dǎo)致的泌尿系統(tǒng)感染。也可以采用經(jīng)下腹前壁膀胱穿刺取尿培養(yǎng)的方法。

以上是各類樣品的取樣方法，可供參考。

也許有人問，是否一定要用我們的取樣管保存液，能不能用生理鹽水或者別的來(lái)替代。下面是我們進(jìn)行的關(guān)于保存液的測(cè)試：

經(jīng)測(cè)試，使用谷禾取樣管保存液，能在-80℃~65℃的條件下保持DNA完整性，室溫有效儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)30天，盡可能保證與新鮮樣本具有一致的菌群構(gòu)成特征。

要想得到較為理想的測(cè)序結(jié)果，首先樣品的質(zhì)量需要得到保障，當(dāng)然樣本提取、建庫(kù)、分析對(duì)最終結(jié)果都會(huì)產(chǎn)生一定的影響，而取樣同樣重要。如果沒有取好，后續(xù)分析再多，可能也得不到想要的結(jié)果。

另外，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯吭O(shè)計(jì)對(duì)于獲得準(zhǔn)確且有意義的結(jié)果也很重要，研究設(shè)計(jì)中應(yīng)注意考慮混雜因素，如果在不確定的情況下，也可以適當(dāng)咨詢我們的技術(shù)顧問，結(jié)合我們的經(jīng)驗(yàn)，給您合適的建議。

當(dāng)然實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，也可能會(huì)受到多種因素的影響，我們會(huì)采用陰性和陽(yáng)性對(duì)照，盡可能減少這些不必要的影響。

總之，做好前期的準(zhǔn)備工作，包括研究設(shè)計(jì)，取樣等，后續(xù)的提取、測(cè)序、分析交給我們~

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