摘要

海洋冷泉中“海底微生物甲烷過(guò)濾器”的效率受上覆海水的擴(kuò)散硫供應(yīng)和深層水庫(kù)的平流甲烷通量控制。高流體通量會(huì)降低硫酸鹽的滲透深度，并將過(guò)濾器限制在靠近沉積物-水界面的非常狹窄的區(qū)域。在這里，我們介紹了一種新的通過(guò)（槽）系統(tǒng)的沉積物流，以模擬天然沉積物中流體/甲烷流和硫酸鹽供應(yīng)之間的平衡。槽能夠在自然流態(tài)下對(duì)完整的沉積巖芯進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。除了傳統(tǒng)的流入和流出取樣外，還可以使用微傳感器和根瘤菌沿沉積物巖芯監(jiān)測(cè)地球化學(xué)參數(shù)。在第一次試運(yùn)行中，在低（11.2 cm y–1）和高流體流量（112.1 cm y–1）條件下，對(duì)來(lái)自埃克恩費(fèi)爾德灣（波羅的海）的兩個(gè)含氣沉積物巖芯進(jìn)行了310天的培養(yǎng)和監(jiān)測(cè)。與低流量（0.29 mmol m–2 d–1）相比，高流量下的甲烷厭氧氧化速率（AOM）高出一個(gè)數(shù)量級(jí)（3.07 mmol m–2 d–1），而甲烷流出量則高出一倍（分別為0.063和0.033 mmol m–2 d–1）。硫化物、硫酸鹽、總堿度、pH值、氧化還原和其他參數(shù)的沉積物剖面提供了沉積物巖心生物地球化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和動(dòng)力學(xué)的重要信息，包括甲烷營(yíng)養(yǎng)、硫酸鹽還原、碳酸鹽沉淀和硫化物氧化。槽系統(tǒng)被證明是研究受平流流體輸送影響的完整沉積物中生物地球化學(xué)參數(shù)時(shí)間演化的有效裝置。

海洋沉積物蘊(yùn)藏著地球上最大的甲烷儲(chǔ)層，包括甲烷水合物（Burwicz et al.2011；Wall-mann et al.2012）。其中一部分甲烷從更深的地方遷移到冷泉處的沉積物表面，并被排放到水柱中。在水深較淺且排放率較高的地方，這種甲烷可以進(jìn)入大氣層，形成全球溫室氣體庫(kù)。然而，大多數(shù)海洋甲烷已經(jīng)被沉積物和水柱中的微生物過(guò)程所消耗（Reeburgh 2007）。

迄今為止，已經(jīng)描述了微生物甲烷氧化的幾種代謝途徑，包括有氧途徑和以硝酸鹽（Ettwig et al.2010）、鐵（Beal et al.2009）或硫酸鹽（Boetius et al.2000）為末端電子受體的幾種厭氧途徑。甲烷與硫酸鹽的厭氧氧化（AOM）是海洋沉積物中主要的甲烷氧化途徑，在甲烷到達(dá)水柱之前消耗了80%以上的甲烷（Hinrichs和Boetius，2002年；Reeburgh，2007年）。

圖1：。冷泉特征生物地球化學(xué)過(guò)程示意圖。電子受體氧（虛線）、硝酸鹽（寬虛線）和硫酸鹽（虛線）的滲透。甲烷（實(shí)線）與滲流流體平流。硫化物（緊密虛線）和碳酸氫鹽是由甲烷的厭氧氧化（AOM）產(chǎn)生的，由甲烷營(yíng)養(yǎng)古菌和硫酸鹽還原菌聯(lián)合體介導(dǎo)。自生碳酸鹽沉淀，硫化物被化能自養(yǎng)生物氧化。

在海洋陸架和大陸邊緣，AOM活動(dòng)主要出現(xiàn)在沉積物的上部10 m處。AOM區(qū)域（圖1）通常被稱(chēng)為“底棲甲烷過(guò)濾器”（Sommer et al.2006）。AOM是由微生物聯(lián)合體介導(dǎo)的，這些微生物利用硫酸鹽作為電子受體。這些菌群由硫酸鹽還原菌（SRB）和厭氧甲烷營(yíng)養(yǎng)古菌（ANME）組成（Boetius et al.2000）。AOM財(cái)團(tuán)減少硫酸鹽并氧化甲烷，生成硫化物和碳酸氫鹽（方程式1）：

在一項(xiàng)新的研究中，Milucka等人（2012）提出了一種不同的反應(yīng)機(jī)制。在這一途徑中，ANME-2古菌通過(guò)產(chǎn)生元素硫作為中間產(chǎn)物單獨(dú)氧化甲烷，進(jìn)一步與二硫化物或其他多硫化物反應(yīng)（式2）：

硫酸鹽還原菌使用二硫化物，并以7:1的比例將其不成比例地轉(zhuǎn)化為硫化物和硫酸鹽（式3）：

產(chǎn)生的硫酸鹽可被古細(xì)菌再次用于甲烷氧化。通過(guò)組合式2和式3，得出式1的凈反應(yīng)。

在沉積物中，甲烷和硫酸鹽同時(shí)耗盡的層位被稱(chēng)為硫酸鹽-甲烷過(guò)渡帶（SMTZ）（Iversen和J?rgensen 1985；Knittel和Boetius 2009）。在該區(qū)域，溶解無(wú)機(jī)碳（DIC）和硫化物（AOM的產(chǎn)物）顯著增加。這兩種產(chǎn)物也可以抑制反應(yīng)。當(dāng)孔隙水中存在高濃度的硫化物時(shí)，硫化物被認(rèn)為是AOM反應(yīng)本身的直接熱力學(xué)抑制劑（Treude et al.2003；Zhang et al.2010）。在高AOM活性下，碳酸氫鹽與鈣反應(yīng)形成自生碳酸鹽（Peckmann et al.2001）：該反應(yīng)可通過(guò)降低沉積物的孔隙度或阻斷流體通道間接抑制AOM（Treude et al.2003；Luff and Wallmann 2003；Kutterolf et al.2008；Karaca et al.2010），從而延緩甲烷的供應(yīng)。

SMTZ的深度取決于硫酸鹽的消耗率、下方甲烷的通量（Borowski等人，1999年），有時(shí)甚至取決于滲漏生物的活動(dòng)（Cordes等人，2005年；Fischer等人，2012年）。除了甲烷營(yíng)養(yǎng)，硫酸鹽還原是海洋沉積物中有機(jī)物最重要的厭氧降解過(guò)程（J?rgensen 1978）；因此，硫酸鹽滲入沉積物的深度還可以由有機(jī)質(zhì)輸入和埋藏率決定（Borowski et al.1999）。在沿海沉積物中，由于有機(jī)碎屑硫酸鹽還原對(duì)硫酸鹽的消耗率很高，SMTZ通常位于海底以下幾十米處，而在有機(jī)質(zhì)貧乏的深海沉積物中，SMTZ的深度可能在地表以下幾十米（Borowski 2004）。在有來(lái)自下方的平流甲烷供應(yīng)的地方，如冷泉和泥火山，即使在深海環(huán)境中，SMTZ也可能非常淺，在前10 cm內(nèi)顯示硫酸鹽耗盡（Treude et al.2003；Niemann et al.2006）。流體的平流輸送產(chǎn)生了更強(qiáng)的甲烷通量，但也限制了硫酸鹽的穿透深度。在這些地點(diǎn)，SMTZ深度的水平變異性通常很高，可以在分米尺度上變化（Treude et al.2003；Niemann et al.2006）。有時(shí)，即使在40 cm的橫向距離內(nèi)，也可以觀察到底棲通量和AOM活動(dòng)的強(qiáng)烈變化（Linke et al.2005）?；瘜W(xué)合成滲漏動(dòng)物群，如硫細(xì)菌墊、管蠕蟲(chóng)和蛤蜊，在硫化物上生長(zhǎng)旺盛，可作為AOM活性和甲烷通量的指標(biāo)（Sahling et al.2002；Torres et al.2002；Levin et al.2003；Treude et al.2003；Mau et al.2006）。

除了空間變異性外，流體通量和相關(guān)甲烷供應(yīng)以及SMTZ深度的相應(yīng)變化也可能暫時(shí)變化。短期流體流動(dòng)波動(dòng)可由阻塞的流體路徑造成，例如通過(guò)天然氣水合物的自發(fā)形成或碳酸鹽的預(yù)循環(huán)（Luff et al.2004、2005），這迫使形成新的運(yùn)移路徑，或通過(guò)潮汐壓力變化（Tryon et al.2002；LaBonte et al.2007；R?y et al.2008；Boles et al.2001）。

流體流動(dòng)也可能在很大的時(shí)間和空間尺度上發(fā)生變化。地震可以引起強(qiáng)烈的流體流動(dòng)脈沖或產(chǎn)生斷層，從而成為流感病毒的新遷移途徑（Tryon et al.2002；Hensen et al.2004；Aiello 2005；Hen-rys et al.2006；Mau et al.2007；Praeg et al.2009；Meister et al.2011）。地震也可能引發(fā)邊坡破壞，隨后導(dǎo)致質(zhì)量浪費(fèi)。大陸坡上的大規(guī)模浪費(fèi)被懷疑會(huì)引發(fā)暴露的天然氣水合物釋放甲烷（Ranero et al.2008；Manga et al.2009）。據(jù)推測(cè)，甲烷通量的另一個(gè)長(zhǎng)期變化是由全球變暖引起的。海底變暖將降低淺層海底天然氣水合物的穩(wěn)定性，并增加甲烷通量（Kvenvolden 1993；LaBonte 2007）。由于北冰洋受到全球變暖的強(qiáng)烈影響，并且由于低溫，與其他海洋相比，天然氣水合物的穩(wěn)定性較淺，因此該區(qū)域可能是首批顯示天然氣水合物中與溫度相關(guān)的甲烷釋放的區(qū)域之一（Buffett和Archer 2004；Biastoch et al.2011）。

上述例子表明，從海底流出的甲烷通量在空間和時(shí)間尺度上都可能變化很大。了解底棲微生物甲烷過(guò)濾器對(duì)這些生長(zhǎng)和活動(dòng)變化的反應(yīng)并不容易，因?yàn)楹茈y在實(shí)驗(yàn)室模擬自然情況，也很難在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行適應(yīng)。之前曾多次嘗試使用流通系統(tǒng)研究AOM活動(dòng)和動(dòng)力學(xué)，即甲烷飽和海水連續(xù)流過(guò)沉積物的系統(tǒng)，以下段落簡(jiǎn)要總結(jié)了這些系統(tǒng)（直接比較見(jiàn)表1）。

Girguis等人（2003、2005）開(kāi)發(fā)了一種連續(xù)流厭氧甲烷培養(yǎng)系統(tǒng)（AMIS），以測(cè)定ANME的生長(zhǎng)速率。AMIS使用完整的沉積物巖心，從底部輸送富含甲烷的海水（包括硫酸鹽），從頂部輸送不含甲烷的海水（包括硫酸鹽）。在反應(yīng)器中制備海水，以確保在大氣壓下甲烷濃度恒定。

在實(shí)驗(yàn)期間獲得的子樣本中確定AOM率。實(shí)驗(yàn)前后測(cè)定了ANME生物體的細(xì)胞豐度。ANME-2在低甲烷通量條件下的生長(zhǎng)速率最高，而ANME-1在高甲烷通量條件下的生長(zhǎng)速率更快。

Meulepas等人（2009年）在大氣壓力下使用了一個(gè)流動(dòng)式膜生物反應(yīng)器，該反應(yīng)器充滿(mǎn)沉積物，并由人工海水（20 mmol L–1硫酸鹽）供應(yīng)。甲烷通過(guò)生物反應(yīng)器永久滲濾。速率由懸浮沉積物物質(zhì)培養(yǎng)過(guò)程中13CH4的周轉(zhuǎn)率確定。運(yùn)行884天后，觀察到非常高的AOM率（286μmol g干重–1 d–1）以及3.8個(gè)月的細(xì)胞倍增率。

Wegener和Boetius（2009）在大氣壓下使用流動(dòng)培養(yǎng)反應(yīng)器，以高流速的富含甲烷的人工海水培養(yǎng)沉淀泥漿。在恢復(fù)甲烷供應(yīng)后，忍受了40天的饑餓時(shí)間，但沒(méi)有導(dǎo)致活動(dòng)減少。相反，硫酸鹽濃度降低（1 mmol L–1）導(dǎo)致AOM活性下降50%。

Deusner等人（2010年）使用了加壓系統(tǒng)（最大35 bar），該系統(tǒng)將溶解甲烷的濃度增加至70 mmol L–1，并使AOM速率比常壓下的甲烷濃度高10-15倍。除了泵和壓縮機(jī)之外，該系統(tǒng)還包括一個(gè)用于向介質(zhì)中富集甲烷的有條件容器和一個(gè)用于培養(yǎng)沉淀泥漿的生物反應(yīng)器。

Zhang等人（2010）還開(kāi)發(fā)了一種高壓/高甲烷流通系統(tǒng)，以防止孵化期間硫化物的抑制。該系統(tǒng)配有一個(gè)條件容器、高壓泵和一個(gè)孵化ves-sel。進(jìn)出口為硫化物測(cè)定提供取樣。

Wankel et al.（2012）使用類(lèi)似于AMIS的流通系統(tǒng)，底部溫度梯度在90°C到頂部約22°C之間，以孵化熱液噴口沉積物。完整的沉積物巖芯從下方供應(yīng)富含甲烷（2.8 mol L–1）的缺氧海水介質(zhì)（硫酸鹽28 mmol L–1），流體流量約為330 cm y–1。AOM率是根據(jù)流入和流出中d13C甲烷和d13C DIC的自然濃度計(jì)算的。該研究表明，AOM在高溫（90°C）下與硫酸鹽還原脫鉤，這可能與鐵還原耦合。

開(kāi)發(fā)上述流通系統(tǒng)和生物反應(yīng)器是為了促進(jìn)AOM生物體的最佳生長(zhǎng)條件（Girguis et al.2003；Meulepas et al.2009），或通過(guò)單獨(dú)調(diào)整系統(tǒng)來(lái)分析選定因素的影響（Wegener和Boetius 2009；Deusner et al.2010；Zhang et al.2010；Wankel et al.2012）。在大多數(shù)情況下，使用的是沉積物泥漿，而不是完整的沉積物巖心（表1）。然而，在天然甲烷滲漏處，條件與傳統(tǒng)的人工設(shè)置非常不同。最重要的是，甲烷和硫酸鹽從不同的方向以不同的速度供應(yīng)：甲烷與來(lái)自更深來(lái)源的流體平流，而硫酸鹽通過(guò)分子擴(kuò)散從上覆水柱輸送（Borowski et al.1996）。此外，甲烷供應(yīng)的變化通常與流態(tài)的變化相關(guān)（Tryon等人，2002年；Tryon和Brown 2004年；Linke等人，2005年；LaBonte 2007年；Füri等人，2010年）。因此，海底甲烷過(guò)濾器不僅受到甲烷供應(yīng)量增加的挑戰(zhàn)，還受到電子受體（即硫酸鹽）穿透深度變淺的進(jìn)一步壓力（Niemann et al.2006）。最后，天然（完整）沉積物與實(shí)驗(yàn)室沉積物泥漿（均質(zhì)沉積物-海水混合物）具有非常不同的特性（例如，孔隙度、滲透率、濃度梯度）。迄今為止，Girguis et al.（2003）和Wankel et al.（2012）的水流系統(tǒng)是唯一使用完整沉積物巖心的系統(tǒng)。然而，該系統(tǒng)缺乏技術(shù)可行性，無(wú)法監(jiān)測(cè)堆芯內(nèi)的生物地球化學(xué)隨時(shí)間的發(fā)展。因此，本研究的目的是開(kāi)發(fā)一個(gè)新系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠?qū)OM活動(dòng)進(jìn)行時(shí)序研究，并在整個(gè)巖芯長(zhǎng)度上，將不同流體/甲烷流動(dòng)狀態(tài)下完整沉積物巖芯中的生物地球化學(xué)參數(shù)關(guān)聯(lián)起來(lái)。槽系統(tǒng)有助于甲烷和硫的自然供應(yīng)，并在實(shí)驗(yàn)期間監(jiān)測(cè)生物地球化學(xué)梯度。在首次使用波羅的海Eckernf?rde灣的含氣沉積物應(yīng)用該系統(tǒng)時(shí)（例如，Treude et al.2005），我們重點(diǎn)關(guān)注以下研究問(wèn)題：

底棲微生物甲烷過(guò)濾器和地球化學(xué)梯度如何對(duì)變化的流體和甲烷流動(dòng)狀態(tài)作出反應(yīng)，以及達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)的反應(yīng)時(shí)間有多長(zhǎng)？

在甲烷供應(yīng)增加和硫酸鹽滲透減少的情況下，底棲甲烷過(guò)濾器去除甲烷的效率如何？

材料和程序

插槽系統(tǒng)

槽系統(tǒng)設(shè)計(jì)用于模擬原狀沉積物巖心中的自然滲流條件，其中甲烷從底部平流輸送，硫酸鹽從巖心頂部擴(kuò)散供應(yīng)。根據(jù)Widdel和Bak（2006），用于提供電子受體和供體的液體由硫酸鹽還原菌的缺氧海水培養(yǎng)基組成。缺氧硫酸鹽介質(zhì)（SO42–濃度19 mmol L–1，鹽度22 psu，根據(jù)研究地點(diǎn)的自然濃度：Whiticar 2002；Treude et al.2005），用于模擬“海水”條件，即允許從沉積物表面擴(kuò)散硫酸鹽供應(yīng)，無(wú)甲烷。甲烷富集培養(yǎng)基（CH4濃度約930μmol L–1，鹽度22 psu），用于模擬下方的“滲流”條件，無(wú)硫酸鹽。在下文中，這兩種介質(zhì)根據(jù)其流動(dòng)方向和成分被稱(chēng)為“海水”和“滲流”介質(zhì)。海水介質(zhì)從帶有氮?dú)忭斂盏膯蝹€(gè)儲(chǔ)液罐中輸送（圖2）。為了提供滲流介質(zhì)，該系統(tǒng)由兩個(gè)相連的儲(chǔ)層組成，其中一個(gè)儲(chǔ)層為氮?dú)猓▋?chǔ)層1），另一個(gè)儲(chǔ)層為甲烷（儲(chǔ)層2）。儲(chǔ)層2通過(guò)蠕動(dòng)泵將富含甲烷的介質(zhì)直接輸送至沉積巖芯底部（詳情見(jiàn)下文）。一旦儲(chǔ)層2中的介質(zhì)液位降低，產(chǎn)生輕微的欠壓，就從儲(chǔ)層1中補(bǔ)充新介質(zhì)（氮?dú)忭斂眨?。在?chǔ)層2中，來(lái)自?xún)?chǔ)層1的介質(zhì)富含甲烷。通過(guò)讓進(jìn)入的介質(zhì)通過(guò)甲烷頂空下落，增強(qiáng)了甲烷頂空與介質(zhì)之間的平衡。

圖2：。插槽系統(tǒng)示意圖。將培養(yǎng)基儲(chǔ)液罐儲(chǔ)存并在10°C的冰箱柜中冷卻。培養(yǎng)基從頂部進(jìn)入堆芯，模擬缺氧海水。富含甲烷但不含硫酸鹽的下部介質(zhì)從底部進(jìn)入巖芯，模擬流體滲流。CH4儲(chǔ)層中的滲流介質(zhì)富含甲烷。所有介質(zhì)均通過(guò)泵和管道輸送。所有磁芯均配有快速連接器，以避免斷開(kāi)時(shí)空氣侵入，并配有三行21個(gè)硅密封孔用于取樣。沉積物芯下方的玻璃纖維過(guò)濾器防止沉積物流失到槽系統(tǒng)的下部。流出的廢水（頂部）收集在一個(gè)瓶子中。

為了追蹤巖心內(nèi)滲流介質(zhì)的遷移，我們使用溴作為惰性示蹤劑。雖然溴在滲流介質(zhì)中以標(biāo)準(zhǔn)濃度（560μmol L–1）存在，但在海水介質(zhì)中僅以痕量濃度（6μmol L–1）存在。Resazurin被用作兩種介質(zhì)中氧污染的指示劑（Visser等人，1990年）。有關(guān)介質(zhì)組成的更多詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱下文（“實(shí)驗(yàn)設(shè)置”和表2）。所有培養(yǎng)基均儲(chǔ)存在10°C的冰箱柜中，避光保存。

表2：。槽系統(tǒng)中使用的兩種不同介質(zhì)的鹽濃度。含硫酸鹽的海水介質(zhì)從頂部輸送，含甲烷的滲流介質(zhì)從底部輸送，不含硫酸鹽。在最后一行中，表示介質(zhì)頂部空間的氣體。

在該系統(tǒng)中，介質(zhì)由蠕動(dòng)泵（Medorex TL/10E，最小/最大泵容量0.1μL min–1/400μL min–1）使用Santropen（可高壓滅菌、高柔性、高抗腐蝕）管（內(nèi)徑0.5 mm，外徑1.6 mm）輸送。在氮?dú)夤?yīng)（氣罐）、介質(zhì)儲(chǔ)罐和泵之間以及泵和沉積物芯之間，使用了Iso Versenic（可高壓滅菌、非常耐腐蝕、非常低的氣體滲透性）管（內(nèi)徑1 mm，外徑3 mm）。管接頭由聚丙烯制成（Brandt GmbH）。

聚碳酸酯芯襯（氣密，總長(zhǎng)30 cm，內(nèi)徑6 cm，外徑6.8 cm；圖3D）配有三條垂直的取樣孔線（每條線21個(gè)孔，直徑4 mm，取樣孔之間的距離5.8 mm），并用無(wú)殘?jiān)瑁ˋquasil，Probau）密封。內(nèi)襯在頂部和底部都用聚氯乙烯（PVC）制成的蓋子封閉（圖3A、3B）。這些蓋子（頂部和底部）有一個(gè)帶有分配器容器的流入管（圖3B）。流出口（僅頂蓋）位于該容器后面。丁腈橡膠（NBR）O形圈位于蓋的內(nèi)邊緣，用于密封蓋和襯里之間的連接。在襯里的底部，固定一個(gè)過(guò)濾器支架（圖3C），以固定一個(gè)玻璃纖維過(guò)濾器（直徑6 cm，孔徑5μm）。過(guò)濾器防止沉積物顆粒進(jìn)入分配器容器。沉積物芯通過(guò)快速連接器（聚丙烯，較冷的產(chǎn)品）連接到泵系統(tǒng)，使管道易于連接和斷開(kāi)，無(wú)需氧氣侵入。泵和泵芯儲(chǔ)存在冰箱中，溫度為10°C，且在黑暗中。有關(guān)SLOT系統(tǒng)中所用沉積物巖心的現(xiàn)場(chǎng)取樣和實(shí)驗(yàn)設(shè)置的詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱下面的“現(xiàn)場(chǎng)取樣（Eckernf?rde Bay）”和“實(shí)驗(yàn)設(shè)置”。

圖3：。槽襯套的單個(gè)組件。（A）頂蓋（外部視圖，PVC），帶進(jìn)水管（中、長(zhǎng)、分配容器未顯示）和出水管（短、右），（B）底蓋，帶進(jìn)水管和分配容器（PVC），（C）帶開(kāi)口的過(guò)濾器支架（PVC），（D）帶三行取樣孔的槽內(nèi)襯（聚碳酸酯），內(nèi)部配備過(guò)濾器支架（聚碳酸酯），頂蓋（進(jìn)出口），和底蓋（流入口）。

插槽系統(tǒng)孵化期間的取樣程序和分析

在槽芯孵化期間，在孵育過(guò)程中的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，使用硅填充取樣孔進(jìn)行rhi-zons孔隙水亞取樣（Meijboom和Noordwijk 1991）或水平微傳感器測(cè)量（pH、氧化還原電位、硫化物；Revs-bech和J?rgensen 1986）（硫化物在32、80、129、169、234、303和360天后；pH在169、234、303和360天后；氧化還原電位在32、129、169、303和360天后；總培養(yǎng)時(shí)間376天）。

孔隙水取樣

對(duì)于使用根進(jìn)行的孔隙水取樣（圖4C和4D），小心地從取樣孔中去除硅，并將用高壓鹽水（salin-ity 22 psu）預(yù)濕的根（根際，CSS-F，長(zhǎng)5 cm，直徑2.5 mm，孔徑0.2μm）緩慢推入沉積物中。之后，在孔周?chē)脽o(wú)殘留硅（Aquasil、Probau）密封根瘤，并在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)保持在沉積物芯內(nèi)。對(duì)于重復(fù)的孔隙水取樣，從根中去除前0.5 mL殘留水并丟棄。隨后，對(duì)1.0-1.5 mL孔隙水進(jìn)行取樣（3 mL luer lock注射器，Becton，Dickinson and Company），并將其轉(zhuǎn)移至2 mL塑料瓶（安全鎖管，2 mL，Eppendorf）中，用于隨后的總堿度（TA）、硫酸鹽、溴化物和氯化物分析（見(jiàn)下文）。根據(jù)Seeberg-Elverfeldt et al.（2005），我們計(jì)算，最多只能對(duì)3 mL孔隙水進(jìn)行取樣，以避免相鄰深度段的交叉取樣。

圖4：。槽芯取樣程序：（a）通過(guò)帶有pH針傳感器（左）和參考針電極（右）的硅填充取樣孔進(jìn)行微傳感器測(cè)量；（b）用硼硅酸鹽注射器和快速接頭進(jìn)行流出取樣；（c）核心底水中的微傳感器和根線；（d）穿過(guò)硅密封取樣孔的針狀傳感器；（e）通過(guò)取樣孔使用根線進(jìn)行孔隙水取樣。

在使用根瘤菌進(jìn)行孔隙水取樣之前，使用硼硅酸鹽玻璃注射器（luer，5 mL，Poulton&Graf GmbH）對(duì)流出介質(zhì)（圖4B）進(jìn)行取樣，流出介質(zhì)位于系統(tǒng)頂部，并通過(guò)一根等速管（5 mm長(zhǎng)，3 mm直徑）連接到快速耦合器。兩種流入介質(zhì)（“海水”和“滲流”）直接在將管道連接至巖心的快速連接器之前，使用管接頭和硼硅酸鹽注射器（見(jiàn)上文）進(jìn)行取樣。對(duì)于甲烷樣品，將2 cm3培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有5 cm3 2.5%（w/v NaOH）的10 mL血清瓶中。立即用丁基橡膠塞關(guān)閉小瓶。剩余的樣品體積（約1.5-2 cm3）儲(chǔ)存在塑料瓶（安全鎖管，Eppendorf，2 mL）中，用于總堿度滴定和離子分析。

微傳感器分析

我們使用鋼針傳感器對(duì)沉積物巖心中的地球化學(xué)參數(shù)（pH、氧化還原電位、硫化物）進(jìn)行微傳感器分析（Revsbech和J?rgensen 1986）（圖4A、D和E）。針式傳感器較不易損壞，并且很容易通過(guò)硅填充孔穿透芯襯套。然而，這種類(lèi)型的傳感器通常比普通玻璃傳感器有更長(zhǎng)的響應(yīng)時(shí)間，這取決于溫度、傳感器年齡和沉積物類(lèi)型。由于沉積物芯的溫度接近10°C（測(cè)量期間通過(guò)冷包穩(wěn)定），并且必須在室溫下進(jìn)行測(cè)量，因此傳感器必須在每個(gè)測(cè)量點(diǎn)適應(yīng)新的溫度，這增加了響應(yīng)時(shí)間。因此，在穿過(guò)取樣孔后，允許傳感器在5到15分鐘之間進(jìn)行調(diào)整，直到宣布某個(gè)值有效（至少為響應(yīng)信號(hào)t90的90%）。測(cè)量以約2 cm的間隔進(jìn)行，即每隔一個(gè)采樣孔進(jìn)行一次，但沉積物-水界面除外，該界面上的測(cè)量直接在界面上方和下方進(jìn)行。使用微電極公司（MI 411 B，量規(guī)20）的微型傳感器測(cè)量pH值。對(duì)于三點(diǎn)校準(zhǔn)（pH 4.01、6.89和9.18），使用默克公司的標(biāo)準(zhǔn)pH緩沖液。使用Unisense、Den-mark（RD-N，尖端直徑0.8 mm）的傳感器或氧化還原針傳感器（MI-800，25號(hào)儀表，微電極公司）測(cè)量氧化還原電位。用pH值為4和7的緩沖液中飽和二氫喹啉溶液的兩點(diǎn)校準(zhǔn)對(duì)傳感器進(jìn)行校準(zhǔn)。傳感器手冊(cè)提供了與標(biāo)準(zhǔn)氫電極（SHE）相關(guān)的氧化還原電位（mV）。硫化氫（H2S）由丹麥Unisense的針式微型傳感器測(cè)量（H2S-N，尖端直徑0.8 mm）。傳感器通過(guò)6種標(biāo)準(zhǔn)NaS溶液（0、100、200、500、1000、2000μmol L–1）進(jìn)行校準(zhǔn)，這些溶液在無(wú)氧磷酸鹽緩沖液（>4 pH）中制備，TiCl含量為10%v/v。根據(jù)Jeroschewski et al.（1996），使用H2S濃度、pH值、鹽度和溫度計(jì)算總硫化物濃度（包括H2S、HS-和S2-）。對(duì)于缺失的pH值曲線（運(yùn)行32、80、129天），使用7.5的pH值（培養(yǎng)基制備pH值）。

實(shí)驗(yàn)終止和巖心切片

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用根瘤菌再次對(duì)孔隙水進(jìn)行取樣（見(jiàn)上文）。這一次，提取了更大體積（每個(gè)取樣孔平均約4.3 mL）的銨、硝酸鹽和硫化物樣品（見(jiàn)下文分析）。拆除頂蓋和底蓋后，將芯放在擠出機(jī)上（直徑5.8 cm）。將兩個(gè)聚碳酸鹽亞巖芯（長(zhǎng)26 cm，內(nèi)徑2.5 cm，外徑2.6 cm）推入巖芯，以測(cè)定硫酸鹽還原和甲烷厭氧氧化（AOM）速率（見(jiàn)下文分析）。盡管子巖芯仍在沉積物中，但在擠出機(jī)的幫助下，將沉積物巖芯推到襯里外，并逐步切成1 cm的甲烷取樣間隔（2 cm3）和2 cm的孔隙度間隔（約1.5 cm3）、總CNS（孔隙度子樣本）和總有機(jī)碳（TOC，孔隙度子樣本）（見(jiàn)下文分析）。在2 cm的間隔內(nèi)采集額外的樣本，用于未來(lái)的工作，如催化報(bào)告者沉積熒光原位雜交（CARD-FISH，0.5 cm3）、脂質(zhì)生物標(biāo)記物（~3 cm3）和RNA/DNA（2 cm3）分析。