[ 摘要]

近年來, 隨著研究的深入, 一氧化氮(NO)越來越多的生物學(xué)功能逐漸被發(fā)現(xiàn)。 以往國內(nèi)外很多報道都證實(shí) NO 在抗微生物感染方面起到重要作用, 然而近年來的一些發(fā)現(xiàn)表明, NO 對微生物的生長還起到保護(hù)作用, 這種保護(hù)作用體現(xiàn)在 NO 能促進(jìn)細(xì)菌的耐藥及在氧化應(yīng)激和壓力應(yīng)激時對微生物的保護(hù)等方面。 本文綜述了 NO 對微生物生長影響作用的兩面性 及其機(jī)制的研究進(jìn)展。

隨著一氧化氮(nit ric ox ide , NO)在促進(jìn)血管舒張方面的 作用被發(fā)現(xiàn), NO 的生理和病理作用逐漸受到人們的重視, 并 成為當(dāng)前的一個研究熱點(diǎn)。 近年來對其在感染損傷方面作 用的研究亦取得了很大的進(jìn)展。 傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為 NO 是抗感 染損傷的一個重要分子, 在細(xì)菌、真菌、病毒等感染中, 活化 的巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生大量 NO 來殺傷微生物。 然而最近的 一些研究表明, NO 對于微生物的生長是有保護(hù)作用的, 這種 作用體現(xiàn)在 NO 在不良環(huán)境下對微生物的保護(hù)。 本文將從 殺傷和保護(hù)兩方面對 NO 影響微生物的生長進(jìn)行闡述。

1、NO 對微生物的殺傷作用

作為活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞毒效應(yīng)分子, NO 能 介導(dǎo)巨噬細(xì)胞抑制和殺傷細(xì)菌、真菌等微生物, 是機(jī)體抗感 染防御體系中的重要因子之一。 促使微生物自身體內(nèi)產(chǎn)生 NO 也是藥物發(fā)揮氧化應(yīng)激作用殺傷微生物的重要機(jī)制[ 1] 。

1 .1、 NO 對細(xì)菌的殺傷作用

Nameda 等[ 2] 用β -葡聚糖和 吲哚美辛誘導(dǎo)小鼠腹腔感染細(xì)菌, 導(dǎo)致感染性休克, 在應(yīng)用NOS 抑制劑后, NO 代謝產(chǎn)物產(chǎn)量下降, 小鼠的死亡率升高。 用 NOS 抑制劑 2 周后, 小鼠各器官細(xì)菌的數(shù)量明顯上升 , 腹 膜細(xì)胞中 TNF -α、IL -1β 、IL -6 等的濃度上升。 Webert 等[3] 在小鼠氣管內(nèi)滴入銅綠假單胞菌誘導(dǎo)肺炎的產(chǎn)生, 然后 將小鼠暴露在含有一定濃度 NO 的空氣中。 結(jié)果顯示, 與對 照組相比, 暴露在 NO 條件下的小鼠內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (iNOS)活性下降, 但氮氧化物的水平明顯上升, 細(xì)菌數(shù)量明 顯減少, 白細(xì)胞浸潤程度降低, 而機(jī)體的氣體轉(zhuǎn)換沒有受到 影響。 Canthaboo 等[ 4] 用百日咳桿菌感染野生型小鼠和 iN- OS 缺失型小鼠, 結(jié)果顯示 iNOS 缺失型小鼠對百日咳桿菌更 為敏感。 Eng elsman 等[ 5] 在外科手術(shù)器具材料上添加 NO 釋 放涂層, 在體外實(shí)驗(yàn)中能有效抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿 菌、銅綠假單胞菌等的感染, 但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中這種效果卻 不明顯。

1.2、NO 對真菌的殺傷作用

NO 對真菌的殺傷作用與細(xì) 菌相似。 Kim 等[ 6] 用血小板激活因子(PAF)預(yù)處理白假絲 酵母菌感染的小鼠, 導(dǎo)致 iNOS mRNA 和蛋白質(zhì)的高表達(dá)。 當(dāng)加入 NF-κB 抑制劑后, 這種效果被顯著地抑制。 PAF 預(yù) 處理小鼠避免了因白假絲酵母菌感染而引起的死亡, 腎臟中 真菌的增長也變緩。 然而加入 iNOS 抑制劑后及在 iNOS 缺 失小鼠中, PAF 的這種保護(hù)作用消失。 數(shù)據(jù)顯示 NO 在 PAF 誘導(dǎo)的保護(hù)機(jī)體抵抗白假絲酵母菌感染中發(fā)揮了重要作用。

在 NO 對微生物殺傷作用的研究中, 大量的研究集中于 機(jī)體通過巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 NO 來殺傷侵襲的微生物 。 然而也 有一些研究指出, 促使微生物自身產(chǎn)生 NO 是藥物發(fā)揮氧化 應(yīng)激作用來殺傷微生物的重要機(jī)制。 Osório 等[ 7] 研究指出 NO 在甲萘醌等誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用:液泡 膜蛋白 Btn1p 在酵母空泡運(yùn)輸精氨酸過程中發(fā)揮重要作用, BTN1 基因缺失型菌株對于甲萘醌、二酰胺、過氧化氫等引起 的氧化應(yīng)激產(chǎn)生耐受。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 基因缺失菌相比野生型菌 株, 藥物作用后活性氧生成減少。 他們認(rèn)為 BTN1 基因缺失 型菌株不能有效轉(zhuǎn)運(yùn)精氨酸來合成 NO , 從而減少了氧化損 傷, 而外源加入精氨酸則能夠逆轉(zhuǎn)這種氧化耐受。 Almeida 等[ 8] 也認(rèn)為 NO 在酵母細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用:他們 用過氧化氫誘導(dǎo)酵母細(xì)胞發(fā)生凋亡, 從中檢測到 NOS 的活 性升高, NO 的生成增加。 這種 NO 的生成依賴于左旋精氨 酸, 在加入 NOS 抑制劑后, 細(xì)胞 NO 生成量下降, 同時對過氧 化氫產(chǎn)生耐受。

1 .3、NO 對微生物殺傷作用機(jī)制

NO 是一種帶有不配對 電子的氣體自由基, 可與原核細(xì)胞和真核細(xì)胞內(nèi)許多生物小 分子發(fā)生化學(xué)及生化反應(yīng), 包括氧化還原、離子移位和集團(tuán) 修飾等[ 9] 。 生物體許多細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞都具有 iNOS , 在細(xì)胞因子的作用下這些細(xì)胞能夠產(chǎn)生 效應(yīng)分子 NO , 殺傷微生物。

在病理?xiàng)l件下, NO 可以直接抑制微生物的有氧呼吸能 量代謝;在高濃度時, NO 還可以與體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基等反 應(yīng)生成活性氮氧化合物(RNOS), 再由活性氮氧化合物發(fā)揮 抗微生物感染作用。 例如 NO 與超氧陰離子(O2 -)反應(yīng), 生 成過氧亞硝基陰離子(ONOO -)或三氧化二氮(N2 O3)等一 系列物質(zhì), 介導(dǎo)氧化損傷或亞硝基化損傷[ 10] 。 ONOO -可有 效地氧化蛋白質(zhì)巰基、Fe/ S 中心、鋅指結(jié)構(gòu)、硝基化蛋白質(zhì)的 酪氨酸殘基等, 使許多重要的蛋白質(zhì)或酶失活, 影響細(xì)胞代 謝, 并抑制呼吸鏈酶, 破壞線粒體結(jié)構(gòu), 使 DNA 鏈斷裂, 對微 生物造成殺傷[ 11] 。 另外, NO 是活化巨噬細(xì)胞抑制和殺傷胞 內(nèi)病菌的重要效應(yīng)分子, 它可以通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放腫瘤 壞死因子(TNF)、白介素(IL)等炎癥介質(zhì)介導(dǎo)免疫毒性反 應(yīng), 殺死病菌。

2、NO 對微生物的保護(hù)作用

以往關(guān)于 NO 對微生物生長影響的研究多著眼于 NO 對 微生物的殺傷方面, 然而最近的一些研究表明:NO, 尤其是 微生物自身產(chǎn)生的 NO, 對其抵抗外界惡劣環(huán)境、促進(jìn)微生物 感染宿主, 甚至促進(jìn)微生物耐藥等方面發(fā)揮重要作用。

2 .1、NO 對細(xì)菌的保護(hù)作用

Johnson 等[ 12] 的研究發(fā)現(xiàn), 在 植物生長組織內(nèi)會有纖維二糖(植物細(xì)胞壁的一種成分)的 生成, 而一些植物致病性鏈霉菌屬容易感染生長旺盛的植物 組織。 這些鏈霉菌會產(chǎn)生 NO 等活性氮類物質(zhì)用于一種叫做 thax tomin 的生物合成, thax tomin 能夠抑制植物纖維二糖 的合成, 從而破壞了細(xì)胞壁的完整性, 促進(jìn)細(xì)菌感染植物組 織。 然而在此過程中 NO 的作用尚未研究清楚。

Gusaro v 等[ 13 -15] 關(guān)于 NO, 尤其是細(xì)菌內(nèi)源性 NO 對細(xì) 菌的影響做了長期細(xì)致的研究, 他們用 NO 預(yù)處理枯草桿 菌, 然后加以 H2O2刺激, 結(jié)果顯示用 NO 預(yù)處理細(xì)菌幾秒后 再加以 H2O2刺激能夠大幅提高細(xì)菌的氧化應(yīng)激適應(yīng)能力。 此外他們還認(rèn)為內(nèi)源性 NO 是維持細(xì)菌毒力和細(xì)菌在巨噬 細(xì)胞內(nèi)存活的關(guān)鍵因素:他們比較了 NOS 缺失型和野生型 炭疽芽孢桿菌在小鼠體內(nèi)的毒力以及巨噬細(xì)胞對其 DNA 的 損傷程度, 結(jié)果顯示 NOS 缺失型細(xì)菌感染小鼠所需的半數(shù) 致死量明顯增加, 巨噬細(xì)胞作用后 DNA 損傷也更加顯著。 另外, 他們關(guān)于內(nèi)源性 NO 促進(jìn)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的報道更是 引起了人們的關(guān)注, 他們的研究發(fā)現(xiàn):NOS 基因缺失型枯草 桿菌對于各種藥物的敏感性明顯上升, 而外源性加入 NO 后 細(xì)菌對藥物的敏感性降低, 他們認(rèn)為這種 NO 促進(jìn)細(xì)菌耐藥 作用具有廣譜性。 Husain 等[ 16] 的研究結(jié)果與上述結(jié)果相 似, 他們研究了沙門菌屬在氧化應(yīng)激環(huán)境下存活的條件, 發(fā) 現(xiàn)用 NO 預(yù)處理細(xì)菌 , 阻斷有氧呼吸電子傳遞鏈, 增加細(xì)菌 內(nèi) NADH 的含量, 能夠使細(xì)菌耐受 H2O2導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。

2.2、NO 對真菌的保護(hù)作用

相對于 NO 對細(xì)菌的保護(hù)作 用, 關(guān)于 NO 對真菌 的保 護(hù)作用 的研 究報 道較 為少 見。 Chiang 等[ 17] 的研究表明微量的 NO 能夠降低金屬離子對釀 酒酵母的殺傷:他們用不同濃度的銅離子刺激釀酒酵母, 然 后加以不同濃度的 NO , 結(jié)果顯示低濃度的 NO 能夠降低金 屬離子的毒性, 對菌體起到保護(hù)作用。 Domitr ovic 等[ 18] 也研 究了 NO 對釀酒酵母的保護(hù)作用, 他們將釀酒酵母置于不同 的溫度環(huán)境及流體靜力壓下, 觀察其對于熱刺激及壓力刺激 的耐受能力。 結(jié)果顯示:預(yù)先用 NO 供體短時間處理酵母細(xì) 胞能夠增強(qiáng)其耐高溫和耐壓力刺激的能力。

2.3、NO 對微生物保護(hù)作用機(jī)制

NO 對微生物的保護(hù)作 用是最近幾年研究較為深入的一個方向。 然而其作用機(jī)制 目前尚未有統(tǒng)一的看法。 Gusar ov 等[ 13 -15] 認(rèn)為 NO 促進(jìn)細(xì) 菌耐受氧化應(yīng)激的關(guān)鍵在于 NO 可以抑制芬頓效應(yīng)。 芬頓 效應(yīng)是一種在亞鐵離子(Fe2+)催化下 O2 -和 H2O2相互作用 生成羥自由基(OH ·)的反應(yīng) , NO 抑制了芬頓效應(yīng), 從而減 少了對細(xì)菌具有很強(qiáng)殺傷作用的 OH · 的產(chǎn)生。 此外 NO 還 可以增強(qiáng)過氧化氫酶的活性, 兩方面共同導(dǎo)致了細(xì)菌對過氧 化氫的耐受。 而 Husain 等[ 16] 并不認(rèn)同此觀點(diǎn), 他們認(rèn)為 NO 阻斷 了細(xì)菌有 氧呼吸電 子傳遞 鏈, 增加了細(xì) 菌內(nèi)的 NADH 的含量, 從而促進(jìn)了氧化劑的還原, 阻止了氧化劑對 細(xì)菌的殺傷。 Chiang 等[ 17] 研究發(fā)現(xiàn)微量 NO 可以降低銅離 子對釀酒酵母菌的毒性, 認(rèn)為 NO 抑制了銅離子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因 子 Mac1 的活性, 導(dǎo)致了對銅離子有高度親和性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Ctr1 的表達(dá), 從而阻止了高濃度銅離子進(jìn)入細(xì)胞。 Domitrovic 等[ 18] 認(rèn)為 NO 增強(qiáng)酵母耐高溫和耐壓力刺激的機(jī)制并不相 同, 但共同的可能是 NO 在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮了重要作用。

3、NO 作用的雙重性

NO 廣泛產(chǎn)生于各種生物細(xì)胞中, 在哺乳動物、細(xì)菌、真菌體內(nèi)均有產(chǎn)生。 并在各種生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要 作用[ 19-20] 。 在關(guān)于 NO 與微生物生長之間關(guān)系的研究中, 人 們發(fā)現(xiàn)在不同的濃度、不同的環(huán)境下, NO 會對微生物的生長 造成截然不同的影響。 例如 Chiang 等[ 17] 的研究表明微量的 NO 能夠激活銅離子敏感性轉(zhuǎn)錄因子(Ace1), 加速金屬離子 的代謝, 從而降低金屬離子的毒性, 對細(xì)菌起到保護(hù)作用;而 高濃度的 NO 反而抑制 Ace1, 減緩金屬離子的代謝, 增加了 金屬離子的毒性。 目前 NO 對微生物生長所造成的雙重影 響尚待研究。 另外, 一些 NO 在微生物生長過程中起到了特 殊的作用, 例如 Barraud 等[ 21] 研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌內(nèi)源性 產(chǎn)生的 NO 能夠促使細(xì)菌由菌絲態(tài)向游離態(tài)轉(zhuǎn)換, 合理利用 NO 的這種性質(zhì), 將 NO 供體與殺菌藥合用可以增強(qiáng)藥物對 菌絲態(tài)細(xì)菌的殺菌效果。 此外, 不同的微生物, NO 所表現(xiàn)出 的作用可能也完全不同, 例如文獻(xiàn)[ 7 ,13 -15] 關(guān)于 NO 對于真菌 和細(xì)菌耐藥性的研究報道截然相反, Osó rio 等[ 7] 認(rèn)為促使微 生物自身產(chǎn)生 NO 是藥物發(fā)揮氧化應(yīng)激作用來殺傷微生物 的重要機(jī)制;而 Gusaro v 等[ 13 -15] 認(rèn)為微生物自身能夠產(chǎn)生 NO 是增強(qiáng)細(xì)菌感染宿主, 甚至產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制。 這 似乎是兩種矛盾的觀點(diǎn)。 但仔細(xì)推敲, 我們認(rèn)為是可以解釋 的:外界刺激殺傷微生物時, 早期微生物自身免疫機(jī)制發(fā)揮 作用, 產(chǎn)生 NO , 這時的 NO 對于微生物是有保護(hù)作用的[ 14] , 而藥物大量長時間刺激誘使微生物產(chǎn)生大量 NO, 這時的 NO 又是有殺傷作用的。 所以我們認(rèn)為 NO 產(chǎn)生的時間、環(huán)境、 濃度不同是它表現(xiàn)為雙刃劍作用的重要原因。 但這只是我 們的猜測, 其中的機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。 目前關(guān)于微生物 內(nèi)源性 NO 的研究報道并不多見, 內(nèi)源性 NO 在微生物的生 長過程中發(fā)揮著怎樣的作用尚不得而知。 但我們相信, 就像 在哺乳動物體內(nèi)的作用一樣, NO 在微生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面 也發(fā)揮著獨(dú)特的作用, 而且這種作用深受濃度、環(huán)境、菌種等 的影響。

對微生物來說, NO 是一把雙刃劍, 在適宜的環(huán)境中 NO 對微生物起到保護(hù)作用, 而條件不適則有可能對其造成殺 傷。 更加深入地研究 NO 對微生物生長造成的影響及其機(jī) 制, 必將有利于我們尋找新的抗感染藥物作用靶點(diǎn)和新的抗 感染治療手段。