摘要

微囊藻菌落可在沉積物中越冬，并可通過補(bǔ)充接種水柱，促進(jìn)微囊藻水華的年度復(fù)發(fā)。通過微觀實(shí)驗(yàn)，通過闡明底棲微囊藻在不同沉積條件下的細(xì)胞數(shù)量、光合活性和毒素含量動態(tài)，定量研究了底棲微囊藻的存活能力。在5°C下22周的實(shí)驗(yàn)中，沉積物樣品中微囊藻菌落的豐度沒有顯著降低，而超過90%的底棲生物種群在25°C條件下3個(gè)月內(nèi)死亡。微囊藻菌落在表層沉積物需氧條件下的存活率顯著低于深層沉積物厭氧條件下的存活率。毒性銅綠假單胞菌和無毒魏森伯格假單胞菌表現(xiàn)出相似的生存能力，雖然銅綠假單胞菌在15和25°C下的最終存活效率高于威森伯格假單胞菌。微囊藻毒素配額在5和15°C下保持穩(wěn)定，但在25°C下顯著降低。底棲微囊藻群體的光合活性逐漸降低，在較高溫度下下降幅度較大。我們的研究表明，大多數(shù)底棲微囊藻群體能夠成功越冬，微囊藻毒素得以保存，光合活性得以維持，顯著增加了水華形成的風(fēng)險(xiǎn)。然而，多年來，它們無法在亞熱帶淺水湖泊的沉積物中積累。

介紹

微囊藻是富營養(yǎng)化淡水中常見的主要成花生物，可產(chǎn)生一系列被稱為微囊藻毒素（MCs）的強(qiáng)效肝毒素。在富營養(yǎng)化湖泊中，大量藍(lán)藻微囊藻可能在仲夏和秋季沉入沉積物中，然后在湖底存活（Tsujimura等人，2000年）。沉積物中微囊藻菌落的累積生物量可被視為一個(gè)種子庫，并可在重新注入水柱后作為中上層水華的接種物，有助于淡水生態(tài)系統(tǒng)中這種藍(lán)藻的生態(tài)成功和水華形成（Brunberg and Blomqvist 2002；Sabart et al.2014）。Verspagen等人（2005年）模擬了伏爾克拉克湖（荷蘭）底棲微囊藻和中上層微囊藻種群之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)沒有底棲微囊藻的補(bǔ)充，使藻華減少了50%。通過分析太湖（中國）水華的時(shí)空模式，發(fā)現(xiàn)水華可能首先發(fā)生在前一年深秋藍(lán)藻積累的地區(qū)（Tan等人，2010年）。在美國伊利湖，調(diào)查和分析表明，沉積物最有可能是微囊藻水華的來源（Chaffin等人2014；Sabart等人2014）。鑒于底棲微囊藻的重要性，需要對微囊藻群體的底棲行為進(jìn)行研究，以更好地了解微囊藻水華形成的機(jī)制（Latour等人，2004年；Verspagen等人，2005年）。

目前對微囊藻群落底棲行為的研究主要依靠實(shí)地調(diào)查。在不同水體的沉積物中觀察到大量存活的微囊藻菌落，盡管豐度存在顯著差異（Cires等人2013年；Latour等人2004年；Misson等人2012b），從100到200000毫升不等?1（Verspagen等人，2004年），底棲微囊藻的動態(tài)可能呈現(xiàn)不同的趨勢（Ihle等人，2005年；Tsujimura等人，2000年）。在Quitzdorf水庫（德國），底棲微囊藻的生物量在春季末急劇下降，在夏季和冬季保持穩(wěn)定（Ihle等人，2005年）。在琵琶湖（日本）的淺部，從冬季到初夏，底棲微囊藻的生物量減少，而在瓦倫圖納斯金湖（瑞典）（布倫伯格，1999年）或琵琶湖的深部（70-90米）（Tsujimura等人，2000年）沒有記錄到生物量下降。在某些沉積物條件下，微囊藻菌落可以存活長達(dá)7年（Bostr?m等人，1989年；Latour等人，2007年；Misson等人，2012b）。據(jù)我們所知，底棲微囊藻的生存能力尚未得到定量研究。因此，我們旨在確定影響底棲微囊藻菌落存活能力的主要因素，以及這些菌落在各種沉積物條件下的存活時(shí)間。

實(shí)地調(diào)查不足以清楚地揭示微囊藻菌落在沉積物條件下的生存能力，因?yàn)榈讞⒛以遑S度的減少可能歸因于細(xì)胞溶解或底棲菌落的補(bǔ)充。為了明確確定沉積物中微囊藻菌落的存活能力，必須抑制浮游和底棲種群之間菌落的交換。因此，需要通過模擬實(shí)驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)和定量研究，以評估微囊藻菌落在不同沉積條件下的存活能力。此外，只有當(dāng)它們具有足夠的生理活性以恢復(fù)生長時(shí)，底棲微囊藻群才有可能接種水柱并促進(jìn)該屬的夏季開花特征。使用PhytoPAM檢測沉積物中分離的微囊藻菌落的光合作用活性是評估底棲微囊藻菌落恢復(fù)生長潛力的有效方法。

有毒和無毒微囊藻菌落總是共存于水體中。有毒和無毒細(xì)胞的相對比例以及細(xì)胞內(nèi)的含量水平?jīng)Q定了底棲微囊藻種群的毒性，它們是下一季微囊藻水華的孕育劑。微囊藻物種可以在整個(gè)底棲階段保存MCs；保存在有毒細(xì)胞中的MC可能有利于越冬，在沉積物中以及MC含量高或低的有毒細(xì)胞之間的生存能力方面，有毒微囊藻物種可能比無毒微囊藻物種具有競爭優(yōu)勢（Ihle et al.2005；Mohamed et al.2006；Latour et al.2007；Misson et al.2012b）。Schatz等人（2007年）證明，微囊藻細(xì)胞裂解刺激剩余細(xì)胞產(chǎn)生更多MC，從而增強(qiáng)其生存能力。此外，拉圖爾等人（2007年）發(fā)現(xiàn)，長期掩埋的底棲微囊藻種群的MC含量顯著高于新定居種群的MC含量（拉圖爾等人，2007年）。因此，確定有毒和無毒微囊藻菌落之間的競爭差異，以及在沉積物條件下有毒細(xì)胞中MC含量的動態(tài)變化非常重要。

我們在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了微宇宙，以定量研究微囊藻菌落在各種底棲條件下的生存能力，主要目的是（i）闡明微囊藻菌落在各種沉積物條件下的生存能力，（ii）確定有毒和無毒微囊藻菌落之間是否存在影響底棲生物存活的種間差異，以及（iii）揭示底棲微囊藻的光合活性和細(xì)胞內(nèi)MCs的動態(tài)。這項(xiàng)研究的結(jié)果將進(jìn)一步加深我們對底棲微囊藻種群行為和富營養(yǎng)化湖泊中微囊藻水華形成機(jī)制的理解。

材料和方法

藻類培養(yǎng)和培養(yǎng)條件

本研究中使用的兩種菌落形成微囊藻菌株的純培養(yǎng)物銅綠微囊藻CHAB 5059和威森伯格微囊藻CHAB 1211由李仁輝教授（中國科學(xué)院水生物研究所，武漢，中國）提供。有毒的銅綠假單胞菌菌落含有大量的MC-LR和MC-RR。在衛(wèi)森伯格支原體細(xì)胞中未檢測到MCs。如前所述（Tan等人，2010年）分離菌株，并在25°C條件下，在MA培養(yǎng)基中以12小時(shí)光照/12小時(shí)暗循環(huán)培養(yǎng)（Kasai等人，2004年）。在實(shí)驗(yàn)之前，對培養(yǎng)物進(jìn)行放大，直到每個(gè)菌落形成微囊藻菌株獲得足夠的生物量。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，每個(gè)菌株的菌落特征保持不變。

沉積物和水

沉積物和水來自東湖（北緯30°33.0367N，東經(jīng)114°22.4832E）。沉積物通過60μm的篩子過濾，以防含有可能損壞微電極的大顆粒（OXY25，Unisense，丹麥）。一小部分沉積物經(jīng)過冷凍干燥、粉碎，并通過60μm的篩子。湖水通過0.45μm的醋酸纖維素膜過濾以去除藻類。

實(shí)驗(yàn)環(huán)境

本實(shí)驗(yàn)使用塑料注射器（50ml）；注射器筒的頂部被切斷，底部用橡膠柱塞密封（圖1）。沉淀物、藻類和過濾水被一層一層地添加到桶中。首先，添加15毫升沉積物作為初始層。添加沉淀物和菌落微囊藻（3 mL）的混合物作為第二層。第三層和第四層分別與第一層和第二層相同。接下來，將0.5g凍干沉淀物均勻地灑在第四層上。最后，緩慢添加10毫升過濾后的湖水作為第五層，以模擬沉積物和微囊藻的再懸浮。注射器筒的外部覆蓋著錫箔，頂部覆蓋著透氣膜。為了比較有毒銅綠假單胞菌和無毒威森伯格假單胞菌的存活能力，將這些裝置分為三組，并添加了各種藻類。第一組中添加銅綠微囊藻，第二組中添加魏森伯格微囊藻。在第三組中，將等量的綠膿桿菌和威森貝格氏桿菌混合并添加到桶中（稱為微囊藻屬）。三組微囊藻菌落的細(xì)胞密度均為2.3×108±1.2×107。將微宇宙（圖1）置于培養(yǎng)箱中，并在三種不同溫度（5、15和25°C）下保持在黑暗中。

圖1模擬微囊藻群落的底棲環(huán)境

使用微電極（OXY25，Unisense，丹麥）測量水-沉積物界面的氧氣分布，如之前的研究（Tian等人，2015）所述。

取樣

我們的前期實(shí)驗(yàn)表明，微囊藻菌落的壽命隨溫度變化很大。因此，針對不同的溫度設(shè)置了不同的采樣間隔。實(shí)驗(yàn)持續(xù)了22周，每1周、2周或4周采集一次樣本。每次取樣時(shí)，從每組中隨機(jī)抽取兩桶進(jìn)行取樣。

去除覆蓋水后，用柱塞桿緩慢排出沉積物芯（圖1）。將兩層混合沉淀物和微囊藻菌落（即第二層和第四層）切掉并轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，并向每根管中添加15 mL 40%Percoll（瑞典阿默森生物科學(xué)公司）溶液。充分混合后，將混合物以4000×g離心10分鐘。將含有微囊藻菌落的上清液通過孔徑為10μm的篩網(wǎng)過濾，以收集所有藍(lán)藻菌落。然后輕輕沖洗篩子上的微囊藻菌落，并將其懸浮在10毫升MA培養(yǎng)基中，以供日后分析。

微囊藻細(xì)胞密度的測定

為了計(jì)數(shù)底棲微囊藻，將含有微囊藻菌落的10mL MA培養(yǎng)基的等份（各1mL）用0.01mol L水解?如前所述（Wang等人，2015），在85°C溫度下使用NaOH進(jìn)行8分鐘，并使用流動攝像機(jī)和顯微鏡（FlowCAM）進(jìn)行自動研究。

存活率在沉積物中存活一段時(shí)間的微囊藻細(xì)胞百分比被用來代表微囊藻菌落在不同環(huán)境條件下的存活率。

微囊藻的光化學(xué)效率分析

PSII的最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）是使用脈沖調(diào)幅熒光監(jiān)測系統(tǒng)（德國沃爾茲Phyto PAM）測量的。暗適應(yīng)5分鐘后，在弱光條件下（0.15μmol/m）測量原始熒光（Fo）和最大熒光（Fm）?2秒?1）以及3516μmol/m的飽和光脈沖?2秒?分別為1，持續(xù)0.8秒。PSII的最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）計(jì)算為Fv/Fm=（Fm）?Fo）/Fm（Wang等人，2014年）。

微囊藻毒素的提取與測定

在4°C條件下，使用3毫升100%甲醇（最終濃度為75%）在含有微囊藻菌落的10毫升MA培養(yǎng)基中提取等份（各1毫升）的MC 24小時(shí)。離心后，使用由Waters 2695分離模塊、Waters 2996光電二極管陣列檢測器和Waters Empower色譜軟件（Waters，USA）組成的系統(tǒng)，通過高效液相色譜法（HPLC）測定上清液中的MC含量（Wu等人，2009）。通過比較238nm處的峰面積與MC標(biāo)準(zhǔn)品（美國西格瑪·奧爾德里奇）的峰面積來確定MCs的濃度，并在Synergi Hydro RP C18柱（4μm，250mm×4.6mm）上分離MCs。

統(tǒng)計(jì)分析

通過重復(fù)方差分析（ANOVA）考察了溫度、微囊藻種類和沉積層對存活率、光化學(xué)效率和微囊藻毒素含量的影響。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。Mauchly檢驗(yàn)用于通過重復(fù)方差分析評估球形度，溫室-蓋瑟球形度估計(jì)用于糾正違反Mauchly檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)中的自由度。在三因素重復(fù)方差分析中發(fā)現(xiàn)顯著交互作用的情況下，對每個(gè)溫度進(jìn)行單因素方差分析。在進(jìn)行單因素方差分析后，進(jìn)行事后Tukey檢驗(yàn)以確定顯著分組。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用IBM SPSS Statistics 19軟件（美國IBM公司）進(jìn)行。使用Origin 8.0軟件（美國OriginLab）生成圖形。