摘要

光生物制氫效果很好 其重要性，因?yàn)樗型a(chǎn)生清潔的可再生能源。 在自然界中，綠藻不能產(chǎn)生氫氣，因?yàn)?氫化酶對(duì)氧氣極度敏感的結(jié)果。 然而，我們發(fā)現(xiàn)硅化誘導(dǎo)的綠藻 聚集體可以實(shí)現(xiàn)可持續(xù)的光生物氫 即使在自然有氧條件下也能生產(chǎn)。 核心- 綠藻聚集體的殼結(jié)構(gòu)創(chuàng)造了一種平衡 光合電子產(chǎn)生和氫化酶之間 活性，從而允許產(chǎn)生氫氣。 這一發(fā)現(xiàn) 為太陽(yáng)能驅(qū)動(dòng)的水分解提供了可行的途徑 轉(zhuǎn)化為氫氣和氧氣以開發(fā)綠色能源替代品 通過(guò)使用合理設(shè)計(jì)的細(xì)胞-材料復(fù)合物。

氫氣（H2 ) 被認(rèn)為是一個(gè)有前途的替代品 對(duì)于化石燃料，由于其卓越的轉(zhuǎn)換效率， 環(huán)保，高能量容量。 [1] H2 今天的生產(chǎn)主要依賴蒸汽 碳?xì)浠衔镏卣?、煤氣化?核動(dòng)力水電解，這是能源密集型和不可持續(xù)的。 [2] 太陽(yáng)能生物制氫 電源提供了產(chǎn)生 H2 的可能性 那是可再生的 和碳中和，因?yàn)樗苯邮褂萌≈槐M的資源：太陽(yáng)能和來(lái)自 H2O 的電子。 [3] 在自然界， 光合微生物，特別是綠藻，可以 使用氫化酶（一種酶 催化分子氫的可逆氧化） 耦合到光合作用機(jī)器。 [4] 然而，這是 在幾分鐘內(nèi)發(fā)生的短暫過(guò)程 暗光過(guò)渡。 [5] 這是因?yàn)闅浠甘チ怂?在有氧的情況下發(fā)揮作用。 [6] 在黑暗中，細(xì)胞呼吸產(chǎn)生激活氫化酶的厭氧條件。 [7] 在從黑暗走向光明的瞬間， 來(lái)自光系統(tǒng) II (PSII) 反應(yīng)中心的水光氧化反應(yīng) (H2O!2H+ + 1/2O2 + 2 e￠ ) 的光合電子可以傳遞給氫化酶以產(chǎn)生 H2 (2H+ + 2 e￠ !H2)。 然而 光合作用反應(yīng)迅速產(chǎn)生氧氣 使氫化酶失活。 [8] 為了提高光生物 H2 產(chǎn)量，科學(xué)家篩選了 [9a,b] 和 構(gòu)建了具有改善的氧耐受性的突變體和 通過(guò)降低內(nèi)在氫化酶氧敏感性 各種策略。 [9c] 不幸的是，進(jìn)展有限 制作。 目前，硫剝奪是最常見的 用于產(chǎn)生綠色厭氧環(huán)境的方法 藻類。 [7a] 然而，這種代謝處理可以同時(shí)抑制 PSII 活性并逐漸終止隨后的 H2 產(chǎn)生。 [7a, 10] 由于不利結(jié)果，綠藻在 H2 中的大規(guī)模應(yīng)用 生產(chǎn)仍然不現(xiàn)實(shí)。

在自然界中，許多生物體，如硅藻， 球石和趨磁細(xì)菌已經(jīng)從生物礦化過(guò)程中發(fā)展出特定的礦物結(jié)構(gòu) 提供廣泛的保護(hù)和獨(dú)特的功能。 [11] 近期 研究成果表明，仿生礦化可以 作為一種有用的工具來(lái)改造細(xì)胞和病毒，以及 由此產(chǎn)生的細(xì)胞-材料復(fù)合物總是有不同的 來(lái)自原生生物的生物學(xué)特性。 [12] 這里我們 報(bào)告一種可以賦予綠藻的仿生硅化 具有可持續(xù)光生物 H2 的新能力 在自然大氣條件下生產(chǎn)。

蛋白核小球藻 (C. pyrenoidosa) 是一種單細(xì)胞 綠藻在其葉綠體中具有突出的核糖體， 也是少數(shù)商業(yè)化的微藻物種之一 已被大規(guī)模培養(yǎng)。 通常，細(xì)胞是 在單細(xì)胞狀態(tài)下，直徑 3-4 毫米，沒有傾向 自聚合（圖 1a）。 聚（二烯丙基二甲基氯化銨）（PDADMAC） 分子可以模擬硅化蛋白誘導(dǎo) 原位二氧化硅沉積在細(xì)胞表面， [12b, e] 這可以 也適用于綠藻。 仿生后 修改后，硅化的 C. pyrenoidosa 細(xì)胞可以自聚集（圖 1b）。 因此，硅化細(xì)胞具有 降低的 zeta 電位（約 ￠ 3 mV）與 原生細(xì)胞（約 ￠ 15 mV），這有利于 粒子團(tuán)聚（支持信息，圖 S1）。 我們還確認(rèn)細(xì)胞通過(guò) 無(wú)定形SiO2 （支持信息，圖S2）形成 細(xì)胞材料在硅化過(guò)程中聚集。 這 通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞硅化中的 C. pyrenoidosa 密度可以將聚集體尺寸控制在 10-500 mm 中（支持信息，圖 S3 和 S4）。

圖 1. 蛋白核小球藻細(xì)胞及其聚集體。 a) 本地人 使用光學(xué)顯微鏡和掃描電子觀察細(xì)胞 顯微鏡（SEM）。 比例尺：20 毫米（插圖：2 毫米）。 b) 聚合 使用光學(xué)顯微鏡和 SEM 觀察細(xì)胞。 比例尺： 50 毫米（插圖：2 毫米）。 c) 含有 WO3 的天然小球藻培養(yǎng)基 粉末（管的底部）。 d) 本地和聚合的小球藻培養(yǎng)物 管中裝有 WO3 粉末的介質(zhì)。 e) 聚合小球藻 含有 WO3 粉末的培養(yǎng)基（管底）。 酒吧 表示 WO3 的標(biāo)準(zhǔn)顏色變化 在 H2 存在下 在 解決方案。

一些金屬氧化物的變色性質(zhì) 它們的氧化態(tài)已被用于方便的光學(xué) H2 檢測(cè)。 [13] 氧化鎢 (WO3) 是常用的，因?yàn)樗?與 H2 反應(yīng) 生產(chǎn)鎢青銅，其顏色由淺黃色變?yōu)樗{(lán)灰色。 [13] 這里將 WO3 粉末添加到細(xì)胞培養(yǎng)物中作為 環(huán)境大氣下 H2 產(chǎn)量的指標(biāo)。 這 天然和聚集的 C. pyrenoidosa（約 100 毫米）的 H2 生產(chǎn)能力如圖 1 c-e 所示。 在這 實(shí)驗(yàn)中，C. pyrenoidosa（總細(xì)胞密度 培養(yǎng)基為 3.0 × 107 細(xì)胞mL￠ 1 ) 被照亮 在 100 mEm￠ 2 s￠ 1 的光強(qiáng)度下 12 小時(shí)。 在本地 小球藻，WO3 粉末顏色不變表示無(wú) 可檢測(cè) H2 在系統(tǒng)中（圖 1c），與 綠藻不能產(chǎn)生 H2 的傳統(tǒng)觀點(diǎn) 在自然有氧條件下。 然而，在綜合 小球藻，WO3 粉末的顏色變成藍(lán)灰色 （圖 1 e），在溶液中產(chǎn)生 H2 之后 濃度約 10 mmolL￠ 1 （支持信息， 圖 S5)。 需要注意的是，培養(yǎng)基是 暴露在空氣中，因此產(chǎn)生的 H2 聚集的細(xì)胞發(fā)生在自然大氣條件下。

為了定量研究聚集的小球藻細(xì)胞中 H2 產(chǎn)生的特性，我們監(jiān)測(cè)了 H2 和 O2 在使用氣體的密閉玻璃管的頂部空間中 色譜法（圖 2a）。 含有小球藻 (1.2 × 108 細(xì)胞mL￠ 1 ) 加入 60 mL 光照下的密封玻璃管（100 mEm￠ 2 s￠ 1 ）。 為了 原生小球藻，H2 無(wú)法檢測(cè)到頂空 在任何測(cè)量點(diǎn)，頂部空間中的 O2 含量從最初的 21% 增加到 23%。 結(jié)果表明，天然小球藻細(xì)胞進(jìn)行光合 O2 進(jìn)化，但不產(chǎn)生 H2，這是由于 在有氧條件下使氫化酶失活。 有趣的是，觀察到 100 毫米的聚集體以約 0.35 mmolH2h￠ 1 (mg葉綠素)￠ 1 （圖 2a；支撐 信息，圖 S6)。 這個(gè)比率是自然界瞬時(shí)生物質(zhì)燃料產(chǎn)量的 1.75 倍 (0.20 mmolH2h￠ 1 (mg 葉綠素)￠ 1 ).[14] 更重要的是， 這種 H2 的產(chǎn)生不僅限于 幾分鐘; 相反，這種生產(chǎn)被檢測(cè)到 至少 48 小時(shí)。 隨后，H2 的速率 生產(chǎn)開始減少（支持信息， 圖 S6)，這可能是由于聚合受損 聚集體中細(xì)胞增殖產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)（支持信息，圖 S7）。 的生產(chǎn) 在聚合之前，H2 可以持續(xù)至少 60 小時(shí) 結(jié)構(gòu)分解（支持信息，圖 S6 和 S7)。 與原生小球藻相比，我們注意到 O2 聚集體頂部空間的含量從 實(shí)驗(yàn)期間為 21% 至 19%。 這種減少很可能 歸因于消耗 O2 分子的細(xì)胞呼吸 存在于封閉系統(tǒng)中。 在聚集的細(xì)胞中，O2 進(jìn)化減少，因此 H2 產(chǎn)生 增加。 此外，在交替的時(shí)期 明暗（圖 2 b），我們發(fā)現(xiàn)聚集體僅 在光照期間產(chǎn)生 H2； 下未檢測(cè)到 H2 黑暗的條件。 這種明暗切換效應(yīng)暗示著 H2 的產(chǎn)生與光合作用直接相關(guān)。

圖 2. 在有氧條件下聚集的小球藻光生物制氫。 a) H2的量和O2的含量 在 100 mEm￠ 2 s￠ 1 光強(qiáng)下密封管的頂部空間 在不同的時(shí)間段（n=6）。 紅線：O2%。 藍(lán)線：H2amount。 空心方塊：原生小球藻。 實(shí)心圓圈：聚集的小球藻。 b) 帶有聚集小球藻的密封管中的累積 H2 積累 在明暗過(guò)渡期間（n = 5）。 c) 天然和聚集的小球藻 (n=5) 中的體內(nèi)氫化酶活性。 d) 體外氫化酶活性 天然和聚集的小球藻 (n=5)。 e) 光強(qiáng)度下天然和聚集的小球藻 PSII (Fv/Fm) 的最大量子產(chǎn)率 100 mEm￠ 2 s￠ 1 在不同的時(shí)間段（n=3）。 f) DCMU 對(duì)聚集的小球藻 (n=3) 產(chǎn)生的 H2 的影響。

在綠藻中，光合水分解在功能上與活化的氫化酶產(chǎn)生的 H2 相關(guān)。 在 天然小球藻，既不是體內(nèi)也不是體外氫化酶 可以檢測(cè)到活性（圖 2c 和 d），因?yàn)闅浠冈诃h(huán)境存在的情況下失活 氧氣。 [6] 在小球藻聚集體中，體內(nèi)氫化酶 活動(dòng)在前 24 小時(shí)內(nèi)略有增加，然后保持不變 在 4 mmolH2h￠ 1 的相對(duì)穩(wěn)定水平 (mg葉綠素)￠ 1 （圖 2 c），這也高于 H2 的速率 從大氣中生產(chǎn)氬氣（支持信息）。 該結(jié)果表明，氫化酶在 聚集體在大氣氧水平下仍然活躍。 體外檢查證實(shí)存在氫化酶 聚合中的活動(dòng)，并且值甚至從 6.5 至 10.3 mmolH2h￠ 1 (mg 葉綠素)￠ 1 在前 24 小時(shí)內(nèi) （圖2d）。 這些結(jié)果表明聚合 處理可能有利于氫化酶的表達(dá) 提高 H2 生產(chǎn)潛力。

除氫化酶外，影響持續(xù)光生物 H2 產(chǎn)生的另一個(gè)重要因素是其催化作用。 底物，即光合電子，起源于 來(lái)自 PSII 反應(yīng)中的水氧化反應(yīng) 中心。[15] PSII 是一種大的多亞基膜蛋白 可以捕獲光子能量、分離電荷和 驅(qū)動(dòng)類囊體膜中的電子轉(zhuǎn)移。 [16] 該 PSII 的最大量子產(chǎn)率 (Fv/Fm) 已被廣泛研究 用于評(píng)估 PSII 的活性。 Fv/Fm 的值在 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)原生小球藻為 0.7， 并最終降至約 0.5（圖 2e）。 這個(gè) 減少很可能是密封環(huán)境引起的應(yīng)力的結(jié)果。 聚合中的 Fv/Fm 參數(shù) 小球藻在開始時(shí)減少到大約 0.5 實(shí)驗(yàn)（圖 2 e），可能是由聚合處理引起的。 然而，最大量子產(chǎn)率 聚集的小球藻中的 PSII 從最初的 值 0.52 到最終值 0.62（圖 2e）。 結(jié)果 表明適當(dāng)?shù)木奂幚韼缀?不影響封閉細(xì)胞中 PSII 的活性，不像 硫剝奪治療的影響。 [17] 化合物 3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲 (DCMU) 是 一種特定的 PSII 抑制劑，可破壞 從 QA 到 QB 的電子， [17] 及其添加到聚合 即使在光照條件下也完全終止制氫 （圖2f）。 這一現(xiàn)象證實(shí)了 氫化酶與光合作用機(jī)器之間的耦合以產(chǎn)生 H2 在聚集的細(xì)胞中。

圖 3. 聚集小球藻的空間功能分化。 a) 微傳感器測(cè)量圖。 b) 氫氣 （藍(lán)色）和 O2 （紅色的） 不同大小的聚集小球藻的微觀結(jié)構(gòu) (n=5)。

微傳感器是研究生物的可靠工具 聚集體中的微環(huán)境（圖 3a；支持信息，圖 S8）。 在這里，我們使用 H2 和 O2 微型傳感器來(lái)檢查我們的聚集體中的內(nèi)部環(huán)境。 在 100 毫米的骨料中，H2 的產(chǎn)量不 在骨料表面檢測(cè)到。 H2濃度 隨著探頭深度的增加而增加，并達(dá)到 最大值（約 1.7 mmolL￠ 1 ) 在聚合核心 (圖 3 b)。 此配置文件暗示 H2 是由核心產(chǎn)生的 細(xì)胞而不是表面細(xì)胞。 相比之下，O2 濃度隨著探針深度的增加而降低。 這 核心微環(huán)境缺氧，O2 核心中心的濃度幾乎為零，其中 氫化酶被激活，從而產(chǎn)生 H2。 聚合的空間 H2 和 O2 分布 小球藻細(xì)胞暗示存在空間功能 細(xì)胞之間的分化（SFD）。

聚合可以被認(rèn)為是自生的 具有分化細(xì)胞功能的結(jié)構(gòu)化核殼復(fù)合體。 表面細(xì)胞暴露在開放環(huán)境中，其功能與原生細(xì)胞相似 藻類。 然而，外面的細(xì)胞也起到了外殼的作用 防止環(huán)境 O2 滲透 進(jìn)入聚合 核。 內(nèi)細(xì)胞的呼吸反應(yīng)消耗了任何 擴(kuò)散的 O2 或光合作用產(chǎn)生的 O2 創(chuàng)造 缺氧域。 這種厭氧條件是由于 O2 擴(kuò)散、PSII 產(chǎn)生的 O2 和隔離系統(tǒng)中的細(xì)胞呼吸之間的動(dòng)態(tài)平衡由下式定義 封閉的外殼空間。 氫化酶和 PSII 活性 可以在這個(gè)域中保持，并且它們的耦合 保證可持續(xù)的光生物 H2 生產(chǎn)。 這 從個(gè)體綠藻到功能轉(zhuǎn)變 聚集的綠藻可以通過(guò) SFD 來(lái)理解 核殼結(jié)構(gòu)：核心細(xì)胞產(chǎn)生氫氣 由于隔離的厭氧微環(huán)境而產(chǎn)生的能力； 殼細(xì)胞保留了原生藻類的功能和 將核心細(xì)胞與開放環(huán)境隔離 （方案1）。

方案 1. 聚集小球藻的空間功能分化 細(xì)胞。

基于核殼的 SFD 對(duì)容量的影響 可以通過(guò)控制聚集體的大小來(lái)調(diào)整光生物 H2 的產(chǎn)生。 對(duì)于具有 直徑約 10 毫米，H2 濃度在兩個(gè) 可以忽略內(nèi)部和外部單元格（圖 3 b）。 O2 濃度保持在同一水平（約 90 mmolL￠ 1） 從外部到核心（圖 3 b）。 結(jié)果表明 直徑為 10 毫米。 然而，隨著骨料尺寸的增加，更多的核心 細(xì)胞被封閉并與開放環(huán)境隔離。 微傳感器測(cè)量表明大聚集體 (500 mm) 表現(xiàn)出比 100 毫米骨料。 H2 濃度達(dá)到 5.3 mmolL￠ 1 在大集合的核心，而 O2 隨著探頭深度的增加，濃度降至零 增加到近 50 毫米（圖 3 b）。 因此，一個(gè)最優(yōu) 用于光生物 H2 生產(chǎn)的 SFD 高度依賴 在總規(guī)模上。

在密閉玻璃管中的實(shí)驗(yàn)表明， 總體而言，相對(duì)于 10 毫米和 500 毫米的骨料， 100 mm 聚集體（具有相同的初始總?cè)~綠素 content) 表現(xiàn)出卓越的制氫能力 （支持信息，圖 S9 和圖 S10）。 這 10 毫米的骨料幾乎不能產(chǎn)生 H2 或性能 氫化酶活性。 頂空 H2 的量 由 500 毫米骨料產(chǎn)生的少于那些 由 100 毫米骨料在不同時(shí)間段產(chǎn)生的 （支持信息，圖 S9）。 雖然體外 500 mm 聚集體中的氫化酶活性較高， 500 mm 聚集體的體內(nèi)氫化酶活性低于 100 mm 聚集體（圖 2 c 和支持信息，圖 S11)。 這很可能 由于內(nèi)部光合作用的不利限制 PSII 產(chǎn)生電子，這證明了 測(cè)量 PSII 活動(dòng)（支持信息，圖 S12）。 這表明氫化酶和 PSII 是保證光生物 H2 生產(chǎn)的關(guān)鍵。 PSII 效率的檢查表明 Fv/Fm 500 毫米聚集體的值僅為 0.1-0.3。 沒有 充足的光合電子，大細(xì)胞中的核心細(xì)胞 聚合體不能通過(guò)氫化酶有效地產(chǎn)生 H2 盡管氫化酶的活性很高。

眾所周知，利用有氧光合作用 在有氧條件下能產(chǎn)生H2的微生物 將是生物 H2 向前邁出的重要一步 生產(chǎn)。 [18] 然而，篩選仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn) 對(duì)于具有顯著氧耐受性的天然物種。 最近，黃等人。 鑒定了一種新的微藻菌株 (Chlorella vulgaris YSL01) 并且該菌株可以連續(xù) 產(chǎn)生高達(dá) 1.9 mLH2 (Lculture)￠ 1 與 5% O2 在 10% 二氧化碳。 [9b] 然而，這種 H2 的產(chǎn)生只發(fā)生在 人工的而不是自然的有氧環(huán)境。 在我們的 研究表明，聚集的綠藻（C. pyrenoidosa）可以 連續(xù)產(chǎn)生約 0.5 mLH2 (30 mLculture)￠ 1， 相當(dāng)于約 17 mLH2 (Lculture)￠ 1 . 這個(gè) 自然條件下的價(jià)值約為 9 倍以上 改良條件下的普通小球藻 YSL01。 [9b] 我們的 研究表明，綠藻聚集體是 在曝光期間能夠光合自養(yǎng) H2 到連續(xù)照明，這提供了第一種情況 在自然有氧條件下持續(xù)產(chǎn)生光生物 H2。 這一成就對(duì)于促進(jìn) 綠色能源發(fā)展。

在我們的嘗試中，原位硅化可以誘導(dǎo)細(xì)胞 C. Pyrenoidosa 的聚集，因?yàn)榧?xì)胞可以 由二氧化硅材料凝聚，這取決于細(xì)胞表面的仿生化學(xué)修飾。 這種化學(xué)品—— 材料細(xì)胞工程可以產(chǎn)生H2的新功能 通過(guò)新型細(xì)胞材料復(fù)合物生產(chǎn) 可行、廉價(jià)且有效。 更一般地說(shuō)， 類似的基于化學(xué)材料的細(xì)胞修飾可能 擴(kuò)展到其他微生物以誘導(dǎo)設(shè)計(jì)的 功能轉(zhuǎn)換。 它進(jìn)一步遵循生物礦化啟發(fā)的策略，通過(guò)化學(xué)和 物質(zhì)途徑。

致謝

這項(xiàng)研究得到了基礎(chǔ)研究的支持 中央高校資助項(xiàng)目（浙大校長(zhǎng)項(xiàng)目） 和國(guó)家自然科學(xué)基金 （21471129 和 31370270）

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