花器官液泡pH對(duì)花色的影響

在花青素類觀賞植物中，顯色物質(zhì)組成相同，顯色物質(zhì)存在的狀態(tài)不同，呈現(xiàn)的花色不同。保持這類植物顯色物質(zhì)穩(wěn)定性的方式有花色苷的自締合作用和花色苷與輔色素結(jié)合的共色素沉著作用。自締合作用中多個(gè)花青素發(fā)色團(tuán)疊加在同一個(gè)左旋軸上，不同角度的遷移導(dǎo)致分裂的圓偏光二色性曲線產(chǎn)生，即光譜有不同的紅移或藍(lán)移趨勢(shì)（圖1）；共色素沉著是顯色物質(zhì)疏水堆積使結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對(duì)花色苷與輔色素濃度、種類有要求，即濃度越高，疏水力越強(qiáng)，顯色物質(zhì)越穩(wěn)定，顏色可由紅向藍(lán)紫移動(dòng)。這些全部依賴于一定的液泡pH，液泡pH改變時(shí)水合能力改變，著色物質(zhì)為適應(yīng)水合環(huán)境，調(diào)整自身使其穩(wěn)定，顏色發(fā)生改變。合適的花色苷與輔色素形成共色素沉著后，還可避免花色苷不穩(wěn)定的無水堿基形成甲基醇從而不顯色，且pH在3-6的區(qū)間內(nèi)輔色素槲皮苷才能和花色苷、金屬離子形成絡(luò)合物。

大豆紫花胞液pH為5.73-5.77，而藍(lán)花胞液pH為6.07-6.10。類似地，矮牽牛紅色花花瓣勻漿pH在5.5左右，而紫色花瓣勻漿pH在6.0左右；飛燕草花瓣表皮組織在紫紅色時(shí)pH為5.5，紫藍(lán)色時(shí)pH為6.6。另外，一些植物花瓣液泡的pH也顯示出類似的變化趨勢(shì)。日本牽牛從花蕾到綻放，花瓣液泡pH一直升高，花蕾時(shí)期紫紅色的細(xì)胞液泡pH為6.6，而開花后藍(lán)色細(xì)胞液泡的pH為7.7；同樣，在八仙花上，用質(zhì)子選擇微電極精準(zhǔn)測(cè)量著色細(xì)胞液泡，藍(lán)色花的液泡pH均值為4.1，而紅色花為3.3。葡萄風(fēng)信子的穗狀花序上半部分為藍(lán)色，下半部分為紫色，紫色部分的勻漿pH為5.84，藍(lán)色部分為5.91。葛根花序上同時(shí)有不同時(shí)間開放的花，新開的花為紫紅色，pH為5.2，老花為紫羅蘭色，pH為5.5。

自然界中沒有藍(lán)色月季花，月季的DRF基因無法將二氫楊梅酮作為底物反應(yīng)生成飛燕草素花色苷，致使無藍(lán)色月季的誕生。研究人員在試驗(yàn)了多種月季品種后選擇了輔色素含量和液泡pH均高的品種作為寄主，將三色堇的F3′5′H基因與荷蘭鳶尾的DFR基因構(gòu)建二元載體導(dǎo)入寄主，在月季DFR基因SiRNA表達(dá)的共同作用下，寄主花瓣最終呈現(xiàn)淡紫色。這對(duì)藍(lán)色月季的培育具有里程碑式的意義。由此可以得出結(jié)論，除飛燕草素花色苷外，較高的液泡pH與高含量的輔色素也是藍(lán)色月季花形成必不可少的元素，這兩個(gè)重要因子在在仙客來、菊花和康乃馨上同樣有所印證。

圖1花色苷堆積偏旋模式及CD曲線展示

調(diào)控花器官液泡pH的分子機(jī)理

在水稻和玉米上發(fā)現(xiàn)，將原來的pH為5.0的營養(yǎng)液調(diào)至pH為8.5，兩種作物根部液泡pH均出現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)，5-10 min后恢復(fù)原來的pH；在玉米營養(yǎng)液中加入NH3，使?fàn)I養(yǎng)液pH升至8.5，玉米根部液泡pH由5.5左右升至6.1左右，并穩(wěn)定下來；在水稻營養(yǎng)液中加入NH3，水稻根部液泡pH由5.4左右升至5.9左右，很快恢復(fù)至pH為5.4左右，并趨于穩(wěn)定，這表明液泡具有一套隔離外界環(huán)境、獨(dú)立調(diào)控內(nèi)部pH的系統(tǒng)。

由于著色細(xì)胞液泡的pH在花色調(diào)控中起重要作用，因此研究調(diào)控花器官液泡pH的分子機(jī)理對(duì)于花色調(diào)控具有非常重要的價(jià)值。前人在調(diào)控著色細(xì)胞液泡pH的研究中，以日本牽牛與矮牽牛作為模式植物，闡明了著色細(xì)胞液泡堿化與酸化的分子機(jī)理。

液泡酸化

野生型矮牽牛花冠呈紅色，矮牽牛突變體出現(xiàn)與原有表型有色差的扇形色塊，或花冠整體顏色偏紫。研究發(fā)現(xiàn)，不同顏色區(qū)域，其液泡pH也不同。

通過進(jìn)一步分離雜交實(shí)驗(yàn)，共分離出PH1-PH7 7個(gè)調(diào)控著色細(xì)胞液泡pH酸化的基因。其中PH4編碼R2R3 MYB蛋白（myeloblastosis蛋白），PH6（后更名為AN1）屬于bHLH蛋白（basic helixloop-helix蛋白），這兩個(gè)蛋白與WDR蛋白（WD是由40個(gè)氨基酸組成，以色氨酸W、天冬氨酸D結(jié)尾的結(jié)構(gòu)域；WDR是WD重復(fù)）AN11結(jié)合，形成MBW（MYB-bHLH-WD）復(fù)合物，調(diào)節(jié)花青素晚期合成通路；PH4-AN1-AN11還激活PH3轉(zhuǎn)錄，PH3編碼WRKY蛋白（含WRKYGQK 7個(gè)保守的氨基酸序列和16個(gè)氨基酸的鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子），可與AN11綁定，與PH4-AN1-AN11形成復(fù)合蛋白，在前饋環(huán)中轉(zhuǎn)錄PH5，同時(shí)，PH1也受PH4-AN1-AN11以及PH3的調(diào)控（圖2）。PH5表達(dá)還受AN2轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控；PH1、PH5表達(dá)均略晚于DRF基因的表達(dá)，可能是因?yàn)镻H1、PH5表達(dá)需要花青素積累；PH1、PH5表達(dá)不影響花青素種類、數(shù)量及結(jié)構(gòu)的變化，不影響細(xì)胞形狀］。

矮牽牛在PH3調(diào)控下花冠呈紅色，ph3突變體中，PH1、PH5表達(dá)減少，花冠表皮著色細(xì)胞液泡pH升高，顏色呈灰紫色。即使PH5過表達(dá)，也不足以使突變體表型恢復(fù)正常，但是當(dāng)PH1也同時(shí)過表達(dá)時(shí)，ph3突變體可以恢復(fù)正常表型。這說明PH1、PH5形成復(fù)合體后，向花冠表皮著色細(xì)胞液泡泵入H+的能力成倍提高。PH5編碼一個(gè)P3AATPase質(zhì)子泵，該質(zhì)子泵主要負(fù)責(zé)向花冠表皮著色液泡泵入H+。PH1編碼的P3B-ATPase，缺乏陽離子結(jié)合與易位的關(guān)鍵——保守天冬氨酸殘基，故不能行使質(zhì)子泵功能，故液泡酸化過程中作為PH5的輔因子，與PH5形成雜聚肽復(fù)合物，共定位于花冠表皮著色液泡上，增強(qiáng)PH5轉(zhuǎn)運(yùn)H+的能力，實(shí)現(xiàn)液泡高酸化。PH1、PH5的同源基因廣泛分布于被子植物中。

圖2 PH基因編碼蛋白調(diào)控液泡酸化可能的模式圖

除控制液泡酸化之外，PH基因還在花青素合成通路、花器官著色細(xì)胞小型液泡類似物vacuolino與中央大液泡融合以及花器官發(fā)育等其它方面起著特殊作用。

PH1與膜蛋白運(yùn)輸有關(guān)。在矮牽牛花冠著色細(xì)胞與月季的花瓣表皮著色細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了一類在花器官表皮著色細(xì)胞中存在、而在葉肉細(xì)胞中并不存在的液泡類似物vacuolino。復(fù)合質(zhì)子泵PH1-PH5出現(xiàn)在vacuolino膜上，中央大液泡上的蛋白受體識(shí)別PH1后，二者形成鏈栓結(jié)構(gòu)，相互融合，PH1-PH5進(jìn)入之前無這兩種蛋白的中央大液泡，這是一種膜蛋白運(yùn)輸方式的分支。矮牽牛突變體ph3和ph4中，vacuolinos無法產(chǎn)生；ph1突變體中vacuolinos與中央大液泡無法融合。

矮牽牛PH3基因與擬南芥TTG2基因高度同源且功能上可以互相代替，由于TTG2參與植株毛狀物的形成以及原花青素積累和液泡酸化，因此PH3基因除了液泡酸化功能外，也參與植株毛狀物的形成以及原花青素積累。

矮牽牛中純合ph3會(huì)導(dǎo)致雌性不育，且會(huì)遏制F3′5′H基因的表達(dá)；花褪色顯性等位基因Fa，只在ph3ph3和ph4ph4背景下表達(dá)；隨著矮牽?；ü诘睦匣?，變紫的背景下出現(xiàn)的紅色斑點(diǎn)與扇區(qū)和ph7有關(guān)。

另外，PH基因還參與果實(shí)風(fēng)味調(diào)控。從柑橘果實(shí)液囊中分離出CsPH5，CsPH5為PhPH5的同源基因，主要負(fù)責(zé)向果肉液囊中泵入氫離子，提高果實(shí)風(fēng)味。但甜瓜中的PH基因編碼的蛋白相似性最高的蛋白是PINs家族的蛋白，即H+/auxin泵，且該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，基因沉默后并未發(fā)生生長(zhǎng)素缺失的表型。

對(duì)這兩種調(diào)控植物花器官與果實(shí)器官酸度的不同基因家族的研究表明，不同植物、不同部位PH基因需要深入研究其功能與意義。